Unser chirurgisches Verfahren ermöglicht es der spezifischen Genbearbeitung von Leptomeningealzellen, ihre Funktion unter vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen wie der Neuroentwicklung und der Ausbreitung der bakteriellen Meningitis zu untersuchen. Um Schäden während der intrazisternalen Abgabe von Endoxifen zu minimieren, verwenden wir eine gebogene Nadel, die gegen die kaudale Kante des Schädels gesichert werden kann, um zu verhindern, dass sie tiefer in das Gewebe eindringt. Das Verfahren kann verwendet werden, um die Rolle von Genen zu untersuchen, die Leptomeningealzellen durch Verlust und Gewinn von Funktionsexperimenten exzieren.
Es kann auch angenommen werden, um den zerebrospinalen Flüssigkeitsfluss zu verfolgen. Die visuelle Demonstration dieser Methode wird eine erfolgreiche Identifizierung der Injektionsstelle für die intrazisternale Injektion und Verständnis dafür gewährleisten, wie die Nadel gegen den okzipitalen Knochen gesichert werden kann. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Hamilton-Spritze mit einer 30 Gauge abgeschrägten Nadel für die Injektion.
Verwenden Sie Zangen, um die Nadel auf 30 Grad drei Millimeter von der Spitze zu biegen. Als nächstes Endoxifen in 10% DMSO auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnen und die Spritze verstauen. Anästhesisieren Sie das Tier in der Isofluran-Kammer.
Stellen Sie dann den Mauskopfhalter so ein, dass sich das Mundstück etwa in einem 30-Grad-Winkel von der Oberfläche des OP-Tischs befindet, und fixieren Sie den Kopf des Tieres auf den Halter. Um die Zugänglichkeit zur Zisterne magna zu verbessern, positionieren Sie den Körper des Tieres etwa 30 Grad von der Oberfläche des Tisches mit dem Nachdruck nach unten geneigten Kopf, der einen Winkel von 120 Grad mit dem Rest des Körpers festlegt und den Nackenrücken ausdehnt, um den Zugang zur Cisterna magna zu erleichtern. Sobald das Tier richtig positioniert ist, ophthalmologische Salbe auftragen, den Nacken rasieren und den Bereich mit Alkoholtüchern und Betadine desinreinigen.
Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen Mittellinienschnitt zu machen, der auf der Ebene des okzipitalen Knochens beginnt und sich nach trägig ausdehnt. Trennen Sie vorsichtig das oberflächliche Bindegewebe und die Nackenmuskulatur, indem Sie seitlich von der Mittellinie mit feiner Spitzenpinzette ziehen, die die Duralmembran über der Zisternenmagnafreilage aussetzt. Positionieren Sie einen kleinen chirurgischen Separator, um die Visualisierung der Zisterne magna während des gesamten Verfahrens zu ermöglichen.
Identifizieren Sie das kaudale Ende des Okzipitalknochens und setzen Sie die zuvor gebogene Nadel direkt darunter ein. Sobald die Dura perforiert ist, lassen Sie die gebogene Spitze der Nadel unter die Oberfläche eindringen, indem Sie die Spritze sanft nach oben und parallel zum Körper des Tieres ziehen, was für eine bessere Stabilität sorgt. Injizieren Sie die Verbindung langsam, um Interferenzen mit dem natürlichen Fluss der Zerebrospinalflüssigkeit zu vermeiden.
Nach der Injektion die Nadel für eine Minute im Inneren ruhen lassen, dann vorsichtig mit Hilfe von feinen Spitzenzangen entfernen. Schließen Sie die Haut mit ein paar Tropfen Cyanoacrylat-Klebstoff und wenden Sie Lokalanästhetikum an der Injektionsstelle an. Entfernen Sie das Tier aus dem Halter und legen Sie es in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen.
Dann stellen Sie sicher, das Tier zu überwachen, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die intrazisternale Injektion von Endoxifen bei transgenen Mäusen, die CreER unter dem Cx30-Promotor exzieren, ermöglicht eine spezifische Rekombination von Leptomeningealzellen, ohne die benachbarten Cx30-Exzessen von Oberflächenastrozyten und parenchymalen Astrozyten im Kortex zu kennzeichnen. Dieses Injektionsprotokoll nutzt die physiologische Bewegung der Zerebrospinalflüssigkeit, so dass die Endoxifen-Lösung über den Subarachnoidenraum verteilt ist, um Leptomeningealzellen effizient neu zu kombinieren, die die Olfaktor-Lampen, Denkrinnen und Kleinhirnüberlagerungen überlagern.
Die Lösung überschreitet nicht die Hirnmeningealbarriere oder kommt in Kontakt mit astroglialen Zellen des Parenchyms im Gegensatz zur systemischen Verabreichung durch orale Gavage. Die Rekombination von Leptomeningealzellen nach intrazisternaler Injektion wurde durch Pdgfr-alpha-Reaktivität identifiziert, während Oberflächen- und parenchymale Astrozyten, die Gfap exdrücken, unbeschriftet blieben. Beim Versuch dieses Experiments ist es wichtig, die Injektionsstelle für die intrazisternale Abgabe zu lokalisieren.
Diese visuelle Demonstration bietet das technische Know-how, um das Verfahren durchzuführen und gleichzeitig das Risiko einer Beschädigung des neuronalen Gewebes unter ihm zu minimieren. Mit dieser Technik können Genablationsstudien durchgeführt werden, um die Rolle von Leptomeningealzellen bei der Kortikogenese und der Regulation der Zerebrospinalflüssigkeitsbildung zu untersuchen und zusätzliche Standorte für die Ausbreitung von Bakterien im Subarachnoidenraum zu identifizieren.
