Nuestro procedimiento quirúrgico permite la edición genética específica de las células leptomeningeales para estudiar su función en muchas condiciones fisiológicas y patológicas como el neurodesarrollo y la propagación de la meningitis bacteriana. Para minimizar el daño durante la entrega intracisternal de endoxifeno, utilizamos una aguja doblada que se puede asegurar contra el borde caudal del cráneo para evitar que penetre más profundamente en el tejido. El procedimiento se puede utilizar para sondear el papel de los genes que expresan las células leptomeningeales a través de la pérdida y ganancia de experimentos de función.
También se puede adoptar para rastrear el flujo de líquido cefalorraquídeo. La demostración visual de este método garantizará la identificación exitosa del lugar de inyección para la inyección intracisterna y la comprensión de cómo fijar la aguja contra el hueso occipital. Comience preparando una jeringa Hamilton con una aguja biselada de calibre 30 para inyección.
Utilice fórceps para doblar la aguja a 30 grados tres milímetros de la punta. A continuación, diluir el endoxifeno en 10%DMSO a una concentración de un miligramo por mililitro y rellenar la jeringa. Anesthetizar al animal en la cámara de isoflurano.
A continuación, ajuste el soporte de la cabeza del ratón para que la boquilla esté aproximadamente en un ángulo de 30 grados desde la superficie de la mesa quirúrgica y fije la cabeza del animal en el soporte. Para mejorar la accesibilidad a la cisterna magna, posiciona el cuerpo del animal a unos 30 grados desde la superficie de la mesa con la cabeza inclinada hacia abajo que establecerá un ángulo de 120 grados con el resto del cuerpo y extenderá la parte posterior del cuello para facilitar el acceso a la cisterna magna. Una vez que el animal esté correctamente posicionado, aplicar pomada oftálmica, afeitarse la parte posterior de su cuello y desinfectar la zona con toallitas de alcohol y Betadine.
Utilice tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de línea media comenzando a nivel del hueso occipital y extendiéndose posteriormente. Separe suavemente el tejido conectivo superficial y los músculos del cuello tirando hacia los lados de la mitad con pinzas de punta fina que expondrán la membrana dural que sobrevuela la cisterna magna. Coloque un pequeño separador quirúrgico para permitir la visualización de las cisternas magna a lo largo del procedimiento.
Identifique el extremo caudal del hueso occipital e inserte la aguja previamente doblada inmediatamente debajo. Una vez perforada la dura, deje que la punta doblada de la aguja penetre debajo de la superficie tirando suavemente de la jeringa hacia arriba y paralela al cuerpo del animal, lo que asegurará una mejor estabilidad. Inyecte el compuesto lentamente para evitar interferencias con el flujo natural del líquido cefalorraquídeo.
Después de la inyección, deje reposar la aguja dentro durante un minuto y, a continuación, retírela cuidadosamente con la ayuda de fórceps de punta fina. Cierre la piel con unas gotas de adhesivo de cianoacrilato y aplique anestesia local en el lugar de la inyección. Retire el animal del soporte y colóquelo en una jaula limpia sobre una almohadilla calefactora.
Luego asegúrese de monitorear al animal hasta que recupere la conciencia. La inyección intracisterna de endoxifeno en ratones transgénicos que expresa CreER bajo el promotor Cx30, un reportero fluorescente inducible permite la recombinación específica de células leptomeningeales sin etiquetar a los vecinos Cx30 que expresan astrocitos superficiales y astrocitos parénquimales en la corteza. Este protocolo de inyección aprovecha el movimiento fisiológico del líquido cefalorraquídeo para que la solución de endoxifeno se distribuya por todo el espacio subaracnoideo para recombinar eficientemente las células leptomeningeales superponiendo las bombillas olfativas, la corteza y el cerebelo.
La solución no cruza la barrera meningeal cerebral ni entra en contacto con células astrogliales del parénquima en comparación con la administración sistémica a través de la gavage oral. La recombinación de células leptomeningeales después de la inyección intracisternal se identificó a través de la reactividad de Pdgfr-alfa, mientras que los astrocitos superficiales y parenquimales que expresaban Gfap permanecieron sin etiquetar. Al intentar este experimento, es importante localizar el lugar de inyección para la administración intracisternal.
Esta demostración visual proporciona el conocimiento técnico para llevar a cabo el procedimiento mientras minimiza el riesgo de dañar el tejido neural debajo de él. Los estudios de ablación génica se pueden realizar con esta técnica para investigar el papel de las células leptomeningeales en la corticogénesis y la regulación de la formación de líquido cefalorraquídeo y para identificar sitios adicionales para la propagación de bacterias en el espacio subaracnoideo.
