Ici, nous présentons des protocoles pour la culture des cellules osseuses au sein d’une plate-forme adaptable de laboratoire sur puce. Ces techniques peuvent être utilisées pour mieux comprendre les mécanismes qui régulent le remodelage osseux induit mécaniquement. Notre système permet une culture à long terme des cellules osseuses, ce qui permet une quantification directe de la formation osseuse et de la résorption en réponse à des environnements de chargement mécanique modifiés.
L’utilisation de ces techniques fondamentales peut mener à des découvertes qui s’étendent à un certain nombre de questions liées aux os telles que l’ostéoporose, la guérison des fractures et l’ostéolyse périprothétique. Pour créer le puits et la couche de microcanal, mélanger le prépolymer PDMS et l’agent de séchage à un rapport de 10 pour un dans une tasse en plastique et mélanger vigoureusement, puis dégazer le polymère pendant 30 minutes. Verser lentement le mélange sur le masque pré-nivelé approprié.
Laissez reposer pendant 30 minutes et faites-le cuire à 45 degrés Celsius pendant 18 heures. Desserrez les bords du PDMS à l’aide d’une spatule de laboratoire effilée et pelez-le soigneusement du masque, puis découpez les copeaux individuels à l’aide d’un scalpel et d’un modèle imprimé en 3D et nettoyez-les à la surface avec du ruban adhésif. Pour faire la couche de membrane PDMS, répétez les étapes précédentes pour mélanger, verser et cuire le PDMS.
Retirez la feuille PDMS de la boîte de nivellement et coupez les membranes individuelles qui correspondent aux dimensions du puits et de la couche de microcanal. Utilisez des étriers pour mesurer l’épaisseur de la membrane au centre et jetez toutes les membranes qui sont en dehors de l’épaisseur désirée, puis nettoyez soigneusement les membranes avec du ruban d’emballage et placez-les sur un morceau de film de paraffine. Pour faire la couche de couvercle PDMS, répétez les étapes précédentes pour mélanger, verser et cuire le PDMS.
Après avoir coupé les couvercles individuels à la taille, percer des trous d’accès à travers le PDMS avec un poinçon biopsie d’un millimètre, puis la surface les nettoyer avec du ruban d’emballage. Activez les surfaces des couches 1 et 2 avec un nettoyeur plasma pendant 30 secondes sur un réglage de puissance de radiofréquence moyenne, puis alignez les trous d’accès dans la première couche avec les microcanaux dans la couche deux et appuyez fermement sur les deux couches ensemble. Pour la conception deep-well, répétez ce processus avec les couches deux et trois en utilisant du ruban adhésif à double face pour fixer le film de paraffine de la couche trois à une surface plane pendant le traitement au plasma.
Coupez l’excès de matière de la membrane PDMS et épluchez soigneusement la feuille de film de paraffine du fond de la puce. Cuire la puce à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes pour augmenter la résistance des liaisons entre les couches PDMS, puis insérer des pointes de distribution d’angle dans les trous d’accès dans le couvercle et les fixer avec un époxy en deux parties à l’aide d’une pointe de micropipette pour appliquer l’époxy autour de chaque pointe. Une fois l’époxy complètement durci, nettoyez la puce à la surface avec 70 % d’éthanol et transférez-la dans une armoire de biosécurité.
Connectez une seringue de cinq millilitres aux bouts de distribution avec des tubes stériles en silicone et remplissez la puce entière de 70 % d’éthanol pendant au moins 30 secondes. Retirez l’éthanol de la puce et stérilisez-le avec de la lumière UV pendant la nuit. Le lendemain, lavez la puce trois fois avec de l’eau distillée, remplissez-la d’eau et retirez le tube des bouts de distribution.
Incuber la puce pendant au moins 48 heures à 37 degrés Celsius. Placez un ressort de compression autour de l’arbre du placage et insérez-le dans le trou central sur le fond de la base, puis fixez le bloc de cadran au fond de la base avec quatre vis auto-tapant. Placer un deuxième ressort de compression autour de la vis centrale.
Insérez la vis dans le trou en forme hexagonale au bas du cadran et vissez l’assemblage dans le trou fileté au centre du bloc de cadran. Vissez quatre impasses homme-femme dans le fond de la base. Retirez le mou de l’appareil en tournant le cadran dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le dessus du placage soit en dessous du haut de la base, puis tournez lentement le cadran dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le dessus du placage soit de niveau avec le haut de la base.
Utilisez une seringue de cinq millilitres pour enlever l’eau de la puce du puits profond et enduire le fond du puits de 200 microlitres de collagène de type I dans de l’acide acétique pendant une heure. Rincez la puce trois fois à l’aide de DPBS avec du calcium et du magnésium et placez-la dans le porte-copeaux. Ensemencer la puce avec des ostéocytes MLO-Y4 dans le milieu alpha MEM complété par le sérum de veau, FBS, et la pénicilline / streptomycine.
Retirez le tube des bouts de distribution, placez la puce dans un plat de culture de puits profonds, et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Après l’incubation, fixer le tube stérile aux bouts de distribution et utiliser une seringue de cinq millilitres pour retirer le milieu de culture usé de la puce, puis remplir lentement la puce avec un milieu frais. Placez le porte-puce dans l’encart rectangulaire sur le dessus de la base du dispositif de chargement, alimentez le tube à travers les fentes situées sur le couvercle et fixez le couvercle à la base.
Appliquez la charge sur les cellules en tournant le cadran dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le déplacement plaqué désiré soit atteint, puis placez le dispositif de chargement dans une boîte à pointes de micropipette P1000 vide et incubez les cellules avec la charge pendant 15 minutes. Après l’incubation, retirez la charge des cellules en tournant le cadran dans le sens inverse des aiguilles d’une montre vers la position de départ d’origine, puis retirez le couvercle de l’appareil, placez le support de la puce dans la plaque de culture profonde et incubez les cellules pendant une période de récupération post-chargement de 90 minutes. Utilisez une seringue de cinq millilitres pour enlever le milieu conditionné de la puce et retirer la puce du support de la puce, puis utilisez une spatule conique pour briser le lien entre le couvercle PDMS et la couche de puits.
Les cellules sont maintenant prêtes à être analysées. La configuration peu profonde peut être utilisée pour analyser l’activité fonctionnelle des ostéoblastes et des ostéoclastes. La formation osseuse des préosteoblastes a été quantifiée à l’aide de taches rouges alizarin et von Kossa.
La résorption osseuse des ostéoclastes a été quantifiée à l’aide de la coloration bleue toluidine et la microscopie électronique de balayage a été utilisée pour vérifier la présence de fosses de résorption. La configuration des copeaux de puits profonds a été utilisée pour induire la mécanotransduction des ostéocytes en étirant les cellules par une distension statique hors plan. Les images d’ostéocytes ensemencés en copeaux démontrent que l’incubation de 48 heures de la puce avec de l’eau distillée est essentielle pour maintenir la viabilité cellulaire dans la morphologie typique.
Pendant les épisodes de chargement, les ostéocytes ont été exposés à un gradient de contrainte induit sur la membrane PDMS. La relation entre la souche équivalente moyenne et le déplacement des plaquettes pour des valeurs comprises entre un et deux millimètres a été déterminée et une carte thermique représentative de la souche induite a été générée. Après chargement, la viabilité cellulaire a été analysée avec la coloration de déshydrogénase de lactate et l’annexe V et l’essai de cellules mortes.
La tache de déshydrogénase lactate des ostéocytes étirés a montré une coloration plus légère près du bord externe du puits, qui correspond à l’emplacement des valeurs plus élevées de contrainte. Notre plate-forme fournit un degré élevé de polyvalence et peut être employée pour étudier une série de facteurs qui règlent le remodelage d’os tel que la méchanotransduction induite par la charge, l’inflammation, et les effets de drogue. Les techniques présentées ici fournissent une base pour développer un véritable organe osseux sur une puce qui pourrait grandement améliorer notre compréhension des subtilités multicellulaires qui régulent la santé des os.
