L’utilisation de l’expression tissulaire spécifique du rapporteur fluorescent polyglutamine chez C.elegans est importante car elle permet la découverte et la caractérisation de régulateurs de protéostase dans le contexte d’un organisme multicellulaire intact. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser et de quantifier le déclin de la protéostasie cellulaire associé à l’âge in vivo, ce qui est essentiel pour obtenir une compréhension mécaniste plus approfondie de la façon dont les organismes maintiennent un repliement et une fonction appropriés du protéome et des effets du vieillissement. L’élucidation des mécanismes capables de préserver la protéostasie facilitera le développement d’interventions ciblées pour le traitement des maladies associées au vieillissement dans lesquelles la protéostase est compromise et pour favoriser un vieillissement en bonne santé.
L’effondrement de la protéostase est un problème clinique massif, car il sous-tend le développement de maladies de mauvais repliement des protéines, y compris la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et la sclérose latérale amyotrophique. Commencez par utiliser des plaques de Petri de 6 centimètres de diamètre pour préparer cinq plaques de gélose pour chaque condition d’essai. Pour les expériences avec l’ARNi, induire la production d’ARNd dans HT115 E.coli transformé et utiliser une gélose ARNi.
Utilisez OP50 E.coli sur une gélose NGM standard pour des expériences sans ARNi. Cultivez les cultures d’E. coli pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en secouant à 220 tr / min. Le lendemain, aumumez les bactéries par centrifugation à 2 400 G pendant 15 à 20 minutes, puis aspirez le surnageant et ress suspendez la pastille dans un dixième du volume de départ de lb.
Aliquote 200 microlitres de bactéries concentrées dans chaque plaque et laisser sécher les plaques ouvertes dans un environnement propre jusqu’à ce que tout le liquide ait été absorbé. Pour synchroniser le C.Elegans avec le traitement à l’hypochlorite, lavez les hermaphrodites gravides deux fois avec un tampon M9, puis transférez-les dans un tube frais et incubez-les dans 5 millilitres de solution d’hypochlorite pendant cinq minutes, en les agitant toutes les minutes. Après l’incubation, faites tourner les animaux et lavez-les trois fois avec un tampon M9.
Laisser les embryons éclore dans des tubes pendant la nuit dans 3 millilitres de solution de M9 avec une rotation à 20 degrés Celsius. Calculez la densité des animaux L1 en déposant 10 microlitres de solution L1 trois fois sur une plaque de 6 centimètres et en comptant le nombre d’animaux L1. Mélangez périodiquement les solutions L1 pour empêcher les animaux de s’installer.
Ensemencez 50 L1 un animal sur chaque plaque, comptez et enregistrez le nombre d’animaux ensemencés, et déplacez les plaques dans un incubateur de 20 degrés Celsius. Alternativement, pour synchroniser les animaux via la ponte, placez cinq à dix jeunes animaux adultes gravides sur chaque assiette pendant quatre à six heures et laissez-les pondre jusqu’à ce qu’il y ait environ 50 œufs par assiette. Retirez tous les adultes gravides et déplacez les assiettes avec les œufs dans un incubateur de 20 degrés Celsius.
Cultivez les animaux jusqu’au stade L4, ce qui prendra environ 40 heures à 20 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 50 microlitres de 160 fois FUDR. Pour mesurer le déclin de la protéostasie dans le tissu musculaire, choisissez 20 animaux et montez-les sur une lame de microscope avec un tampon d’agarose à 3% et une goutte de 5 microlitres d’azide de sodium de 10 millimolaires.
Une fois tous les vers immobilisés, imagez le corps entier des animaux à l’aide d’une lentille de grossissement de 10 X. Utilisez un filtre FITC ou YFP et la même exposition pour chaque animal. Lorsque vous avez terminé, ignorez les diapositives.
Comptez le nombre de foyers dans les muscles de la paroi corporelle de l’animal entier. Les foyers sont des signaux ponctués plus lumineux qui peuvent être différenciés du signal soluble plus faible en arrière-plan. Les jours de pointage, regardez les plaques avec les animaux et enregistrez le nombre d’animaux paralysés, puis retirez les animaux paralysés de l’assiette.
À la fin de l’expérience, calculez le taux de paralysie pour chaque condition et tracez la progression de la paralysie. Pour mesurer le déclin de la protéostase dans le tissu neuronal, montez les vers sur une lame comme décrit précédemment et prenez des images de la pile Z de la tête des animaux sur un microscope composé à l’aide d’une lentille de grossissement 40 X. Ignorez les diapositives après l’imagerie.
Après avoir acquis les images, aplatissez les piles Z et utilisez-les pour quantifier le nombre de foyers dans les neurones situés sur la zone de l’anneau nerveux. Tracez la progression de l’accumulation de foyers YFP à partir des jours 4, 6, 8 et 10. Le deuxième jour de l’âge adulte, choisissez 10 animaux synchronisés dans la plaque et placez-les sur une goutte de 10 microlitres de tampon M9 sur une lame de microscope.
Répétez cette étape au moins quatre fois pour obtenir un échantillon de 40 animaux ou plus. Enregistrez le mouvement des animaux pendant une période de 30 secondes sur un stéréomicroscope avec une caméra vidéo. Une fois que toutes les vidéos avec les animaux à analyser sont enregistrées, lisez la vidéo et notez les courbes du corps de chaque animal.
Tracez le nombre de courbures du corps pour chaque animal dans un graphique à colonnes, où chaque point représente le nombre de courbures du corps en 30 secondes sur l’axe Y et les différentes conditions testées sur l’axe X. Le modèle de répétition de la polyglutamine a joué un rôle déterminant dans l’identification des gènes qui régulent le réseau protéostatique. L’expression de polyQ-YFP spécifique au muscle entraîne une accumulation de foyers fluorescents faciles à quantifier sous un simple microscope à dissection fluorescente.
Les animaux deviennent paralysés au milieu de la vie, car le protéome dans le muscle s’effondre en raison de l’effet protéotoxique du rapporteur. Le déclin associé à l’âge de la protéostase neuronale peut être suivi d’une quantification directe de la formation d’agrégats et du déclin des courbures corporelles coordonnées après avoir placé les animaux dans un liquide. Cette méthode a été utilisée pour montrer que la protéine kinase interagissant dans le domaine homéo, un cofacteur transcriptionnel, influence la protéostasie pendant le vieillissement en régulant l’expression de l’autophagie et des chaperons moléculaires.
La perte de HPK-1 augmente le nombre d’agrégats Q35-YFP qui s’accumulent pendant le vieillissement. Les animaux témoins présentaient en moyenne 18 agrégats, tandis que les animaux traités par le mutant nul HPK1 et l’ARNi HPK1 présentaient en moyenne 28 et 26 agrégats, respectivement. Au huitième jour de l’âge adulte, 77 à 78 % des animaux déficients en HPK1 étaient paralysés, comparativement à seulement 50 % des animaux témoins.
De plus, il a été démontré que la surexpression de HPK1 régule la formation d’agrégats protéiques et protège les animaux vieillissants de la paralysie associée au Q35-YFP pendant le vieillissement. Cette méthode mesure le déclin général du protéome au sein d’un type cellulaire. De nombreuses méthodes existent pour évaluer les changements dans des composants spécifiques du réseau prostatique.
Ensemble, ils fournissent une image complète. Le déclin de la protéostase est une caractéristique du vieillissement. Cette approche permet aux chercheurs de quantifier ce déclin.
Lorsqu’il est combiné avec l’analyse génétique, c’est un outil puissant pour la découverte.
