Ce protocole présente les méthodes les moins coûteuses et les moins techniques pour servir le vieillissement dans les elegans de mer. Un organisme modèle influent en biologie du vieillissement. Le plus grand avantage de ces méthodes est la facilité de mise en œuvre, en utilisant des équipements et du matériel à faible coût.
Les rendre accessibles à tout chercheur, peu importe son expérience ou le financement disponible. Comme une étude sur le vieillissement ancien, il existe une variabilité naturelle de la santé au sein des populations. Par conséquent, il est essentiel que les expériences soient effectuées sur des animaux en bonne santé, bien nourris et étroitement synchronisés.
Pour assurer l’invalidité de déchirure Commencez la préparation d’un milieu de croissance de nématode d’un litre ou d’une plaque de tarière NGM. Ajouter 2,5 grammes de pep tone, 3,0 grammes de chlorure de sodium et 20 grammes de tarière dans une fiole d’un litre avec une barre d’agitation et ajouter de l’eau distillée à un volume final de 970 millilitres. Stériliser la solution de tarière NGM dans une fiole d’un litre à l’aide d’un autoclave standard ou d’un stérilisateur à fluides.
Et laissez la solution remuer jusqu’à ce qu’elle refroidisse à 60 à 75 degrés Celsius. Pendant que la solution refroidit, chauffer un bain de perles à 65 à 70 degrés Celsius. Une fois que la solution de tarière NGM refroidit à 60 à 75 degrés Celsius.
Ajouter les additifs liquides et laisser la solution se mélanger complètement pendant cinq minutes. Plongez ensuite le ballon dans un bain de billes à 65 à 70 degrés Celsius pour empêcher le fluide de se solidifier en versant dans la plaque. Pipeter neuf à 11 millilitres de la solution dans chaque plaque de 60 millilitres.
Lorsque vous avez terminé, replacez la pipette dans la solution chauffée pour maintenir la température et empêcher tout fluide de se solidifier dans la pipette. Répétez la procédure pour toutes les plaques et laissez les plaques NGM a se solidifier pendant la nuit. Une fois solidifiés, utilisez-les pour ensemencer les plaques avec des bactéries ou stockez les plaques dans des récipients scellés jusqu’à trois mois à quatre degrés Celsius pour synchroniser les vers par blanchiment.
Recueillir les nématodes en versant une petite quantité de solution M9 sur une assiette contenant les vers sans trop remplir la boîte de Pétri. Ensuite, agitez doucement la solution M nine pour détacher les vers des pelouses bactériennes. Ensuite, collectez les vers gravides adultes dans un tube de 15 millilitres avec une pipette sérologique.
Éviter de percer la tarière avec l’embout de la pipette. Engraisser les animaux par centr pendant 30 secondes à 1100 fois G, et aspirer le surnageant. Ajouter cinq millilitres de la solution de blanchiment fraîchement préparée à la pastille de ver et vérifier les vers au microscope à dissection toutes les quelques minutes avec agitation vigoureuse intermittente jusqu’à ce que tous les corps de vers adultes soient dissous et qu’il ne reste que des œufs dans le mélange.
Ensuite, granulez les œufs en faisant tourner le mélange d’eau de Javel pendant 30 secondes à 1100 fois G et aspirez la solution de blanchiment. Ensuite, lavez les œufs granulés en ajoutant jusqu’à 15 millilitres de solution M9 et en inversant le tube quatre ou cinq fois pour disperser les œufs et la solution. Encore une fois, centrifuger le tube pendant 30 secondes à 1100 fois G pour granuler les œufs et aspirer la solution de M9.
Effectuez le lavage quatre fois pour éliminer tout agent de blanchiment du mélange d’œufs. Après le quatrième lavage, la centrifusion aspire la solution M9 de 100 microlitres à deux millilitres en fonction du nombre total de vers blanchis. Bien agiter les œufs pour briser les touffes et s’assurer que les œufs sont complètement remis en suspension dans la solution M9.
Alternativement, les animaux peuvent être arrêtés pour une synchronisation temporelle plus étroite en ajoutant 10 à 12 millilitres de solution M9 à la pastille d’œuf dans un tube chronique de 15 millilitres. Laissez les vers tourner dans un rotateur jusqu’à 24 heures à 20 degrés Celsius. Pour approximer l’œuf ou L, une pipette à concentration quatre microlitres du mélange d’œufs sur une plaque NGM assise avec des bactéries.
Ensuite, comptez et calculez les œufs présents par microlitre de milieu. Répéter le comptage trois ou quatre fois pour améliorer l’approximation, en fonction de la plaque d’approximation, du nombre approprié d’œufs ou de L un animaux arrêtés sur la plaque de tarière NGM ensemencée avec des bactéries de votre choix. Mesurer le comportement locomotive des vers par battage.
Déplacer un petit nombre de vers adultes du premier jour d’une plaque de tarière NGM sur 10 à 20 microlitres de solution M9 sous une lunette de dissection. Ensuite, concentrez-vous sur un ver à la fois et comptez le nombre de fois que le spécimen passe d’une formation concave à une formation convexe en 15 secondes. Utilisez un compteur manuel et une minuterie et répétez la procédure pour 10 à 15 vers.
Vieillissez les vers à l’âge désiré et répétez les mesures de battage à tous les âges souhaités. Comme visualisé, les vers plus anciens battent à des vitesses nettement plus lentes. Pour les mesures de quantité et de fertilité.
Chez 10 à 15 vers Caenorhabditis elegans, distinguer L quatre vers dans une plaque tarière NGM séparée ensemencée avec des bactéries de choix. Laissez les animaux grandir pendant la nuit à 20 degrés Celsius et assurez-vous qu’un lot d’assiettes nouvellement ensemencé est prêt pour le lendemain. Pour mesurer la quantité d’œufs pondus par Caenorhabditis elegans, transférez les vers adultes dans une lame de tarière NGM fraîche ensemencée avec cette bactérie pillée toutes les 12 à 24 heures pendant sept à huit jours ou jusqu’à ce que les œufs ne soient plus visibles et comptez le nombre d’œufs pondus sur les assiettes.
Pour mesurer la taille du couvain de Caenorhabditis elegans, transférer les vers adultes sur une plaque à vis sans fin NGM fraîche ensemencée de bactéries toutes les 12 à 24 heures, ou sept à huit jours ou jusqu’à ce que la progéniture ne soit plus visible. Conservez toutes les assiettes contenant des œufs à 20 degrés Celsius. Deux jours après le transfert des vers.
Comptez la descendance développée dans l’assiette. Comptez tous les vers vivants et en développement au stade L quatre ou plus tôt pour vous assurer que la génération F deux ne confond pas les résultats. Retirez tous les vers de l’assiette au fur et à mesure qu’ils sont comptés.
Entretenez les plaques pendant un à deux jours supplémentaires avant de les noter à nouveau pour vous assurer que les animaux dont l’éclosion ou le développement est retardé ne sont pas manqués. L’effet de la méthode de stérilisation sur la durée de vie des nématodes sauvages de type N2 a montré que les changements dans la durée de vie des vers cultivés sur les plaques de vis sans fin NGM étaient similaires à ceux des vers cultivés sur les plaques FUDR de vis sans fin NGM ou aux quatre animaux mutants BN2 cultivés sur les plaques de vis sans fin NGM. L’animal renversé par la FMC a connu une baisse significative de sa durée de vie pour toutes les conditions.
Une diminution substantielle du nombre d’œufs pondus et de la taille du couvain a été observée chez les animaux de type HSF par rapport aux témoins de type sauvage. Certains animaux HSF une surexpression présentaient une stérilité totale, ce qui indique que la santé reproductive peut être inversement corrélée à la longévité. Le taux de battage a fourni une méthode fiable pour mesurer la santé au cours du vieillissement, mesurée par une diminution significative du battement chez les animaux âgés par rapport aux jeunes.
La survie au stress sont des tests fiables pour mesurer la santé des organismes, la tunicamycine qui provoque un stress du réticulum a entraîné une durée de vie réduite quelle que soit la concentration par rapport au contrôle du DMSO. Les niveaux élevés de paraquat ont considérablement raccourci la durée de vie tandis que de faibles concentrations de paraquat ont augmenté la durée de vie en raison de l’effet hormétique. Dans les essais de thermotolérance, la surexpression de HSF one a augmenté la tolérance thermique à 37 degrés Celsius pour toutes les expériences de durée de vie et de vieillissement.
Il est important de se rappeler que les techniques de stérilisation peuvent avoir un effet pléiotropique sur la santé des organismes, ce qui a un impact sur les résultats. De nombreuses approches supplémentaires et complémentaires existent pour mesurer la durée de santé si l’équipement et l’infrastructure sont disponibles, y compris les mesures de la transcription, de l’agrégation des protéines de traduction, de l’organite, de la morphologie et des fonctions métaboliques.
