Les mécanismes d’agrégation des protéines ont jusqu’à présent été étudiés principalement in vitro. Avec notre protocole, nous pouvons faire des études quantitatives similaires dans l’organisme modèle C.elegans. Le principal avantage de notre méthode est la quantification impartiale des nombres d’inclusion.
Et en adaptant ces données de haute qualité à des modèles mathématiques, nous pouvons obtenir des informations sur le mécanisme d’agrégation. L’agrégation des protéines se produit dans de nombreuses maladies, y compris la maladie d’Alzheimer et la maladie de Huntington. Comprendre le mécanisme moléculaire de l’agrégation des protéines in vivo est crucial pour développer de nouvelles thérapies.
Commencez par placer 10 nématodes adultes sur une plaque NGM ensemencée de 6 cm avec un pic de ver de platine pour effectuer une ponte synchronisée. Laissez les adultes pondre les œufs pendant environ deux heures à 20 ° C avant de les retirer de l’assiette. Placez les assiettes avec les œufs dans l’incubateur à 20 ° C.Surveillez le développement des animaux jusqu’à ce qu’ils atteignent l’âge adulte environ le troisième jour après la ponte.
Préparer la plaque de 384 puits en remplissant le nombre requis de puits avec 100 L de tampon M9 complété par 25 mM d’azoture de sodium comme anesthésique. Remplissez un puits par souche pour être imagé. Pour chaque souche, transférez 20 animaux dans un puits à l’aide d’un pic à ver de platine.
Couvrez la plaque avec le couvercle jusqu’à l’évaporation préventive et imagez la plaque dans l’heure qui suit la préparation. Allumez l’instrument et ouvrez le logiciel. Cliquez sur le bouton Lecture à côté de Décharger les plaques de puits et placez la plaque de 384 puits dans le microscope.
Sous Liste d’actions et acquisition de fluorescence 3D, cliquez sur Tester, puis sélectionnez le puits contenant les vers. Définissez Traitement d’image sur Aucun. Et cliquez sur le bouton Lecture pour déterminer la distance de déplacement optimale à laquelle les vers sont correctement centrés.
Réglez la distance ascendante sur 50 m, la distance descendante sur 50 m et l’intervalle de tranchage sur 2 m pour capturer toute l’épaisseur des animaux dans la pile z. Redéfinissez le traitement d’image sur Maximum. Sélectionnez les puits à imager sous Paramètre de balayage de la plaque de puits.
Et puis sélectionnez Tile et Acquire Whole Well. Enregistrez le paramètre de mesure. Et cliquez sur Démarrer la mesure pour démarrer l’expérience.
Ouvrez CellProfiler et faites glisser le pipeline dans la fenêtre Déposer un fichier de pipeline ici. Cliquez sur Oui pour charger le projet. Ensuite, faites glisser les images assemblées dans la fenêtre Déposer les fichiers et le dossier ici.
Cliquez sur le module de saisie de métadonnées. Ajustez l’expression régulière pour extraire du nom de fichier en fonction des noms des images assemblées. Cliquez sur le module de saisie NamesAndTypes et ajustez Sélectionnez les critères de règle pour qu’ils correspondent aux canaux dans les noms de fichiers.
Ensuite, cliquez sur Paramètres de sortie pour sélectionner un dossier pour enregistrer la sortie de CellProfiler. Cliquez sur Démarrer le mode test pour vérifier les paramètres du pipeline à l’aide du premier ensemble de données d’imagerie. Cliquez sur Étape pour parcourir le pipeline, un module à la fois.
Pour ajuster les contours du ver, cliquez sur Afficher l’aide dans le module EditObjectsManually pour voir les instructions. Corrigez les contours. Et puis cliquez sur Terminé pour continuer à exécuter le pipeline.
Cliquez sur Quitter le mode test et analyser les images. Ouvrez le dossier de sortie pour afficher les fichiers de sortie. Et ouvrez les images avec le nom de fichier d’origine suivi des contours pour vérifier si les vers et les inclusions ont été correctement superposés.
Pour commencer à utiliser AmyloFit, nommez le projet et cliquez sur Créer un projet. Cliquez sur Ouvrir pour l’ouvrir. Et créez une session en lui donnant un nom et en cliquant sur Créer et charger une session.
Cliquez sur Ajouter des données et téléchargez le fichier contenant le nombre moyen d’inclusions par animal, en suivant les exigences de format de données indiquées dans le panneau de gauche. Ensuite, cliquez sur Charger de nouvelles données. Définissez Nombre de points à dépasser pour le décalage du point zéro sur 0 et Nombre de points à faire la moyenne sur le plateau à 0 pour ignorer les étapes de prétraitement, qui ne sont pas requises pour les données de comptage d’inclusion.
Ensuite, cliquez sur Soumettre. Répétez cette étape pour chaque concentration de protéines. Sélectionnez Personnalisé dans le panneau Modèle.
Entrez l’équation de nucléation indépendante dans la zone Équation. Et cliquez sur Charger le modèle. Pour Ncells, définissez le type de paramètre sur Global Constant et définissez Value sur 95, correspondant au nombre de cellules musculaires de la paroi du corps.
Définissez les types de paramètres sur Global fit pour Kcell et n. Et à Constant pour m. Entrez les valeurs de m pour les différentes souches dans le panneau de gauche.
Laissez le nombre de sauts de bassin inchangé, puis cliquez sur Ajuster dans le panneau Raccord. Enfin, extrayez l’ajustement en cliquant sur Télécharger les données et Ajuster. Les nombres d’inclusion ont été surveillés dans quatre souches de C.elegans exprimant différentes concentrations de Q40.
Le modèle de nucléation indépendant décrit bien la cinétique d’agrégation. L’ajustement a donné un ordre de réaction de 2,1 et un taux de nucléation de 0,38 molécule par jour et par cellule à une concentration de protéines intracellulaires de 1 mM. Deux répliques biologiques indépendantes dans une étude précédente ont montré des valeurs étroitement correspondantes pour l’ordre de réaction et la vitesse de nucléation.
Une chose à garder à l’esprit est que vous avez besoin d’ensembles de données de haute qualité pour plusieurs concentrations de protéines afin d’obtenir des ajustements fiables. Cette méthode peut être utilisée pour trouver des moyens d’interférer avec l’agrégation des protéines dans un organisme vivant, comme les knockdowns génétiques ou les traitements de petites molécules.
