La simulation dynamique moléculaire est une technique de calcul qui peut être utilisée pour explorer les mouvements moléculaires et peut révéler des changements conformationnels essentiels à la compréhension de la fonction biochimique et cellulaire. Il est difficile de sonder l’éventail des mouvements dynamiques accessibles à une macromolécule. L’utilisation des résultats des simulations dynamiques moléculaires en conjonction avec des données expérimentales permet d’évaluer leur signification fonctionnelle.
Nous démontrerons à l’aide de simulations dynamiques moléculaires comment les mutations observées chez les patients atteints de cancer affectent les confirmations de ciblage EGFR et la liaison ligand. Pour préparer l’EGFR active apo de type sauvage, ouvrez le programme de visualisation Kymera et, dans le menu des fichiers, cliquez sur fetch by ID.Select the Protein Data Bank database et spécifiez le code Protein Data Bank 2GS2. Pour construire les éléments 2GS2 structurels manquants, acquérez ces segments à partir d’autres structures EGFR.
Pour construire les cinq résidus de glutamate 746 à alanine 750 ELREA suppression dans EGFR, cliquez sur favori, séquence, et afficher la séquence pour ouvrir la séquence de type sauvage 2GS2. Et dans la fenêtre de séquence résultante, cliquez sur modifier et ajouter de la séquence pour sélectionner la séquence de format FASTA mutant de suppression. Dans la fenêtre d’alignement, sélectionnez la structure et le modèle ou l’homologie.
Dans la fenêtre popup, spécifiez la structure composite 2GS2 comme modèle et séquence mutante comme requête à modéliser, puis sélectionnez un modèle mutant à partir des modèles résultants en fonction du score zDOPE et de l’inspection visuelle. Pour préparer la structure de kinase EGFR inactive de type sauvage, ouvrez la structure 2GS7 de protein data bank et ajoutez les segments manquants des autres structures EGFR, en modélisant la forme mutante de suppression comme démontré. Pour préparer la structure active de kinase EGFR de type sauvage liée à l’ATP, utilisez la structure 2ITX de protein data bank comme structure principale, construisant les segments manquants en utilisant d’autres structures EGFR et modélisant la forme mutante de suppression en utilisant le modélisateur comme démontré.
Pour construire la structure asymétrique de dimère EGFR de type sauvage, ouvrez 2GS2 dans kymera et cliquez sur les outils, la structure d’ordre supérieur et la cellule unitaire pour convertir la structure en assemblage biologique qui contient les kinases de l’activateur et du récepteur dans l’arrangement asymétrique. Sélectionnez la structure 2GS2 et entrez faire des copies, puis sélectionnez et enregistrez un seul dimère asymétrique à partir des multiples copies du dimère résultant des opérations de symétrie. Pour construire le mutant valin alanine 702, sélectionnez des outils, l’édition de structure, et rotamers pour remplacer alanine 702 par valine.
Ouvrez les structures de Maestro et cliquez sur le bouton assistant de préparation des protéines, puis sélectionnez ajouter des atomes d’hydrogène et remplir les atomes de chaîne latérale manquants et cliquez sur pré-processus. Pour déterminer les états de protonation des résidus ionisables au pH 7.0, cliquez sur affiner et utiliser PROPKA pour optimiser l’orientation des résidus d’asparagine, de glutamine et d’histamine pour la liaison hydrogène, puis minimiser la structure. Pour mettre en place le système de simulation, ouvrez le programme LEAP et importez le champ de force Amber FF14SB et les molécules d’eau TIP3P.
Pour les systèmes liés à l’ATP, importez des paramètres pour l’ATP et chargez la structure. Solvate la structure dans une boîte octaèdre avec des molécules d’eau TIP3P explicites qui s’étend 10 angstroms dans toutes les directions à partir des atomes de surface de la protéine. Vérifiez le système de ceinture et ajoutez les ions nécessaires pour le neutraliser.
Pour modéliser suffisamment les systèmes biomoléculaires, ajoutez des atomes de sodium et de chlorure supplémentaires à la boîte de simulation pour porter la concentration de sel du système à 0,15 molaire, puis générez et enregistrez la topologie et coordonnez les fichiers du système pour servir d’intrants pour la simulation de production subséquente. À l’aide d’Amber, l’énergie minimise d’abord le système de simulation pour contourner les configurations défavorables. Dans le fichier d’entrée de minimisation, ajustez la variable de cycle maximale pour le cycle total de minimisation et le nombre de cycles pour indiquer le nombre de cycles pour l’algorithme de descente le plus raide.
Utilisez la variable de poids de retenue pour appliquer la force de retenue sur les atomes de soluté spécifiés par le paramètre du masque de retenue. Effectuer la minimisation en plusieurs étapes, en abaissant progressivement la retenue appliquée sur les atomes de soluté de 25 à 0 kilocalories par mole angstrom carré, puis utiliser la commande pour exécuter la minimisation. Chauffer le système pendant 100 picosecondes de 0 à 300 Kelvin et utiliser les commandes pour définir une molaire de 10 kilocalorie par retenue angstrom carrée sur les atomes de soluté.
Ensuite, utilisez la commande pour effectuer le chauffage. Equilibrer le système pendant 900 picosecondes sous un ensemble isothermal isobarique et définir une coupure de distance de neuf angstrom pour les interactions électrostatiques à longue portée, abaisser progressivement la retenue de l’atome soluté à 0,1 kilocalorie par mole angstrom carré et finaliser l’équilibration avec une simulation sans restriction de cinq nanosecondes. Exécutez l’égalisation avec la commande comme indiqué.
Ajustez le texte pour permettre la simulation de production pendant 100 nanosecondes avec les conformations enregistrées toutes les 10 picosecondes, puis exécutez la simulation avec la commande comme indiqué. Pour visualiser l’échantillon de conformation pendant les simulations de kinase EGFR de type sauvage et mutant, ouvrez les fichiers de topologie Amber et les fichiers de trajectoire correspondants dans Visual Molecular Dynamics. Et en utilisant des représentations de structure secondaire pratique, analyser la dynamique structurelle globale des protéines de la trajectoire enregistrée.
Ensuite, visualisez les interactions spécifiques entre les atomes et les résidus d’intérêt, comme le pont de sel catalytiquement essentiel à la lysine 745-glutamate 762. Vous pouvez également enregistrer plusieurs conformations échantillonnées lors de la simulation au format Protein Data Bank et ouvrir les conformations de Kymera. Utilisez l’option matchmaker pour superposer les structures sur la structure initiale ou médiane et afficher la structure médiane en solide et le reste des structures alignées en blanc délavé pour permettre la visualisation des mouvements structurels enregistrés avec plus de clarté.
Analyser la stabilité globale des EGFRs de type sauvage et mutant et examiner la flexibilité des différentes unités structurelles, importer la typologie Amber et les fichiers de trajectoire correspondants. Dans le fichier d’entrée de déviation carrée moyen de racine, indiquez les atomes de colonne vertébrale de la structure initiale comme référence pour le raccord carré moyen de racine. Dans le fichier d’entrée de fluctuation carrée moyenne de racine, indiquez les atomes de C-alpha de la structure initiale comme référence pour le raccord carré moyen de racine.
Exécutez ensuite l’analyse avec le programme CPPTRAJ et tracez les données de sortie. Alternativement, pour aligner les ensembles conformationnels et colorer chaque résidu basé sur la déviation carrée moyenne de racine d’atome de C-alpha, ouvrez les conformations dans Kymera et alignez-les avec l’option matchmaker. Sélectionnez les outils, la représentation et le rendu par attribut.
Sélectionnez les résidus des ensembles conformationnels et définissez la déviation carrée moyenne de racine C-alpha comme attributs, puis cliquez sur OK. La trace en chaîne des conformations sera colorée en bleu, blanc ou rouge reflétant les régions de haute, moyenne et faible stabilité structurelle respectivement. Afin d’analyser les interactions entre l’ATP et les EGFR de type sauvage et de suppression, préparez un script du CPPTRAJ pour mener à bien cette tâche. Spécifiez l’analyse des liaisons intermoléculaires de l’hydrogène uniquement avec la variable nointramol et définissez un lien hydrogène avec une distance d’accepteur donneur inférieure ou égale à 3,5 angstroms et un angle de liaison supérieur ou égal à 135 degrés.
Pour évaluer les interactions intramoléculaires, par exemple, entre les résidus catalytiques importants de lysine et de glutamate, spécifiez la lysine comme donneur d’hydrogène et glutamate comme résidus d’accepteur et exécutez le script comme indiqué pour permettre l’analyse du résultat. Pour calculer les énergies libres contraignantes entre l’ATP et les EGFRs de type sauvage et de suppression, préparez les fichiers protein data bank du récepteur ligand de phase gaz et du récepteur ligand dans le programme LEAP et définissez l’ATP comme le ligand et l’EGFR comme récepteur. Définissez la valeur radio née généralisée de M Bond I2. Ensuite, générer la topologie Amber et coordonner les fichiers pour la phase de gaz Protein Data Bank fichiers.
De même, pour calculer les énergies libres liantes entre l’activateur et les kinases du récepteur de type sauvage et les EGFRs valine d’alanine 702, spécifiez la kinase du récepteur comme ligand et la kinase activateur comme récepteur et enregistrez la topologie correspondante et coordonnez les fichiers. Préparez un fichier d’entrée de surface né généralisée mécanique et réglez la valeur IGB à deux et le saltcon à 0,1. Puis en utilisant le mmpbsa.
py script disponible dans Amber, entrez la commande comme indiqué pour exécuter les calculs d’énergie de liaison et d’analyser les données de sortie. Au cours de cette simulation représentative de 100 nanosecondes, le mutant valin alanine 702 a montré une stabilité conformationnelle accrue du segment Juxtamembrane B probablement due à des interactions hydrophobes plus serrées par rapport à l’EGFR de type sauvage. Le mutant valin alanine 702 a également montré une énergie libre inférieure de liaison entre l’activateur et les kinases récepteur par rapport à l’EGFR de type sauvage, représentant des interactions plus favorables dimère qui maintiennent la conformation active de kinase EGFR.
La simulation de la mutation de suppression a eu comme conséquence des fluctuations inférieures d’atome de C-alpha de l’alpha-hélice fonctionnellement clé par rapport à l’EGFR sauvage-type, prolongeant le temps de l’état actif d’EGFR. La mutation de suppression a également eu comme conséquence la formation fréquente des liaisons d’hydrogène entre les atomes polaires latéraux de lysine 745 et de glutamate 762, une interaction clé pour l’activité enzymatique d’EGFR comparée à EGFR sauvage-type. En outre, le nombre de liaisons hydrogène entre ATP et EGFR était plus élevé pour le mutant de suppression que pour l’EGFR de type sauvage.
La mutation de suppression a également eu comme conséquence un mouvement vers l’intérieur de l’alpha-hélice d’état inactif d’EGFR, un changement structurel prévu pendant la transition à l’état actif. En revanche, l’alpha C-helix de l’EGFR inactif de type sauvage a maintenu sa conformation initiale. Pour évaluer l’impact des mutations, il est essentiel de sélectionner les états conformationnels appropriés des structures et de bien préparer et équilibrer ces structures.
Il est important de combiner des simulations dynamiques moléculaires avec des études expérimentales, car la synergie entre ces techniques profite à l’interprétation des résultats et peut éclairer d’autres expériences de laboratoire humide.
