We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.

<ol>
	<li>Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+microscopy+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum-dot-labeled+proteins+in+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid.</a> ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).</li><li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy.">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).</li><li>Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution.">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy:+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells.">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+subunit+locations+determined+in+hydrated+cells+with+environmental+scanning+electron+microscopy.">Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy.</a> Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).</li><li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence-+and+liquid+electron+microscopy.">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. under revision, (2015).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).</li><li>Herbst, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+epidermal+growth+factor+receptor+biology.">Review of epidermal growth factor receptor biology.</a> Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).</li><li>Normanno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366, 2-16 (2006).</li><li>Hofman, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+coalescence+of+different+lipid+rafts.">EGF induces coalescence of different lipid rafts.</a> J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).</li><li>Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+raft+localization+of+EGFR+alters+the+response+of+cancer+cells+to+the+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+gefitinib.">Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib.</a> J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).</li><li>Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton.">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).</li><li>Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneities+in+EGF+receptor+density+at+the+cell+surface+can+lead+to+concave+up+scatchard+plot+of+EGF+binding.">Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding.</a> FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).</li><li>Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+organization+of+ErbB+receptors:+insights+from+microscopy.">The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).</li><li>Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence-+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+and+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells.">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li><li>Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+STEM:+A+new+development+in+environmental+SEM+for+imaging+nano-objects+included+in+a+liquid+phase.">Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase.</a> Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).</li><li>Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells.">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464, 783-787 (2010).</li><li>Stoyan, D., Stoyan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+pair+correlation+functions+of+planar+cluster+processes.">Estimating pair correlation functions of planar cluster processes.</a> Biom. J. 38, 259-271 (1996).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tumor-targeted+fluorescence+imaging+using+near-infrared+non-cadmium+quantum+dots.">In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots.</a> Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Warren, C. M., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+ERBB+receptors:+Multiple+layers+of+diversity+and+control.">Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control.</a> Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).</li><li>Hoenger, A., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+macromolecular+organization+of+cells+by+electron+tomography.">Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).</li><li>Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+topography+of+membrane+receptors+and+signaling+molecules+from+spatial+patterns+obtained+using+nanometer-scale+electron-dense+probes+and+electron+microscopy.">Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy.</a> Micron. 37, 14-34 (2006).</li><li>Pinto da Silva, P., Kan, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-fracture:+a+method+for+high+resolution+labeling+of+cell+surfaces.">Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces.</a> J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).</li><li>Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+quantification+of+amino+acids+and+proteins+in+complex+subcellular+compartments.">Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments.</a> Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).</li><li>Orlov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+immunogold+labelling+of+RNA+polymerase.">Live cell immunogold labelling of RNA polymerase.</a> II. Sci. Rep. 5, 8324 (2015).</li><li>Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clustering+of+the+B+cell+antigen+receptor+demonstrated+by+mathematically+extended+electron+microscopy.">Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy.</a> Front. Immunol. 4, 427 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;étude de la distribution spatiale et la stoechiométrie des protéines membranaires, comme l&#39;EGFR, dans des cellules entières de contexte fournit des informations importantes sur sa fonction d&#39;éventuelles modifications de ceux-ci et de 11 à 14. Il est difficile d&#39;étudier la distribution des monomères, des dimères, et des grappes directement sur ​​un niveau sous-cellulaire en utilisant des procédés biochimiques couramment utilisés, pour lesquels l&#39;information est perdue sur la localisation de la protéine dans la cellule ou les cellules de 15 différences entre les. Les méthodes de marquage décrites ici microscopie et permettent la visualisation des complexes protéiques sur une échelle de longueur de quelques nanomètres de sorte que sa stoechiométrie peut être étudiée dans le contexte de cellules intactes individuelles, 4-7. Cela ne veut pas possible avec (résolution super) de microscopie optique 23 car la résolution est insuffisante pour distinguer les molécules engagées dans un complexe protéique. Transfert Förster Resonance Energy (FRET) est une technique de moyenne d&#39;ensemble &lt;sup&gt; 24, et ne détecte pas nécessairement les dimères et plus grappes de commande comme une conséquence de la courte portée de transfert d&#39;énergie 25. Dosages de ligature de proximité 26 ne mesurent pas les distances et ne sont donc pas capables de distinguer entre une région cellulaire avec une densité élevée en protéines, inévitablement conduit à un certain nombre de proximités détecté par hasard, à partir d&#39;une région cellulaire avec une densité de protéine similaire, mais contenant des protéines complexes présentant des distances distinctes entre les étiquettes. La haute résolution nécessaire pour visualiser les constituants de complexes de protéines est obtenue en microscopie électronique à transmission (MET). Cependant, TEM classique de cellules entières est limitée par l&#39;exigence de minces échantillons / sections de tranchage à travers la membrane 27 plasmatique, ou plasma membrane de rupture ou de déchirure de 28,29 formées au hasard résultant en petits morceaux de membrane. La membrane plasmique est donc pas imagé dans son ensemble, ce qui conduit à un manqued&#39;éventuellement cruciale informations de contexte cellulaire. D&#39;autres difficultés expérimentales pour l&#39;étude de la protéine dans les cellules stoechiométrie proviennent de la protéine de marquage appliquée. Communément immunomarquage utilisé porte la difficulté que l&#39;un-à-un entre le récepteur et la stoechiométrie étiquette ne peut être obtenu avec une sonde d&#39;monovalent; ceci est pas le cas lorsque les anticorps primaires et secondaires sont nécessaires. Pour obtenir des informations sur la stoechiométrie de la protéine, il est nécessaire que la sonde se lie à un epitope unique sur le récepteur et dispose d&#39;un site de liaison pour une sonde fluorescente ou un numéro atomique élevé nanoparticule de l&#39;autre côté. En second lieu, la précision obtenue avec l&#39;anticorps étiquetage est limitée en raison de leur grande taille 30 à 30 nm, de sorte qu&#39;une discrimination entre les protéines voisines simples, des homodimères ou des grandes grappes est impossible, du moins pour les récepteurs de la famille des EGFR. Beaucoup de petites étiquettes spécifiques sont connus dans la littérature et can être appliquée même pour l&#39;étiquetage intracellulaire 31 mais ceux qui ne sont pas couramment utilisés. La longueur de l&#39;ensemble étiquette (EGF-biotine-streptavidine-QD) est d&#39;une dimension similaire à celle du EGFR, et suffisamment petit pour être en mesure de détecter le dimère. En outre, la procédure en deux étapes d&#39;étiquetage décrit éviter l&#39;étiquetage induit regroupement des récepteurs. Notre méthode est pas très difficile, pas beaucoup plus que la microscopie de fluorescence de protéines marquées. Toutefois, un essai doit être effectué avec beaucoup de soin, étant donné que le nombre d&#39;étapes et ajoute une erreur dans l&#39;une des étapes peut conduire à un échec total dans l&#39;expérience. Manipulation des micropuces est pas plus fastidieux que la manipulation des réseaux TEM mais certaines puces vides de formation est recommandée. ESEM-STEM des cellules hydratées entiers est probablement l&#39;aspect le plus difficile, et nécessite au moins un opérateur qualifié et plusieurs jours de pratique afin de parvenir à une résolution d&#39;environ 3 nm comme nécessaire pour visualiser les points quantiques. Radiation barrageâge de l&#39;échantillon objet de l&#39;enquête présente un risque. La pression et la température doivent être soigneusement surveillés pour maintenir une couche d&#39;eau. En outre, l&#39;épaisseur de la couche d&#39;eau peut varier entre les cellules. Il est recommandé de surveiller la présence de la couche d&#39;eau à l&#39;aide du détecteur d&#39;électrons gazeux au-dessus de l&#39;échantillon, comme décrit par ailleurs 6. Régions cellulaires ne devraient être imagées une ou deux fois pour éviter des dommages. Une limitation essentielle du procédé est que l&#39;information à haute résolution sur l&#39;ultrastructure est absent. D&#39;autres techniques, par exemple, cryo TEM, sont nécessaires pour étudier la structure de la protéine, et l&#39;ultrastructure cellulaire 15. Deuxièmement, l&#39;étude de l&#39;interaction dynamique d&#39;un multiple de protéines dans des cellules vivantes en time-lapse microscope est pas possible en raison de dommages de rayonnement, et nécessite l&#39;état de l&#39;art de la microscopie optique 23. Actuellement, notre procédé est pas capable de déterminer le niveau absolu de dimères depuis le lAbeling efficacité est inconnue, mais nous nous attendons à ajouter ces données à l&#39;avenir. Il est néanmoins possible de dire si les dimères sont présents ou non. De la littérature est-elle connue, que même une efficacité de marquage d&#39;environ 15% est suffisante pour détecter des dimères avec une signification statistique suffisante 32. Il est facilement possible d&#39;étudier d&#39;autres récepteurs membranaires par l&#39;intermédiaire de leur ligand, par fragments Fab biotinylé d&#39;anticorps spécifiques, ou par d&#39;autres petits groupes de liaison 7 en utilisant le protocole d&#39;étiquetage en deux étapes décrit. Comme nous avons déjà démontré que deux couleurs différentes (tailles) de points quantiques peuvent être utilisés, et l&#39;étiquetage des nanoparticules d&#39;or a été utilisé dans le travail avant 6, il semble possible d&#39;étiqueter les espèces de protéines multiples dans la même expérience. Le principal défi pour l&#39;étude de la stoechiométrie des espèces protéiques multiples est d&#39;assurer une efficacité de marquage similaire pour les deux espèces ou au moins une normalisation de la stoechiométrie relative obtenue sur le respective efficacité en matière d&#39;étiquetage. Pourtant, les deux boîtes quantiques différents utilisés dans cette étude ne semblent pas différer beaucoup de l&#39;efficacité de l&#39;étiquetage (voir les figures 2 et 4). La méthode décrite impliquant étiquetage en deux étapes avec des points quantiques, et la microscopie par fluorescence et corrélative ESEM-STEM présente une méthode viable pour étudier l&#39;interaction complexe de protéines membranaires dans les membranes plasmiques intactes de cellules entières.

Une nouvelle approche a été introduite récemment, à des cellules entières d&#39;image avec des protéines marquées à l&#39;état liquide à l&#39;aide STEM 1-3, ou la microscopie de fluorescence corrélative et la tige 4-7. Cette méthodologie est capable d&#39;étudier la répartition spatiale des protéines membranaires et des protéines, y compris des complexes de leur stoechiométrie au niveau de la molécule unique dans les membranes plasmiques de cellules entières intactes. Ici, nous décrivons un protocole impliquant un étiquetage spécifique en deux étapes de protéines réceptrices avec des points quantiques fluorescents (QD) 8, et la microscopie optique et corrélative ESEM-STEM. A titre d&#39;exemple, nous avons étudié l&#39;EGFR, une protéine membranaire qui appartient à la superfamille de la protéine kinase. Lors de la liaison ligand, le récepteur active, puis forme un dimère avec un autre EGFR activé; la cascade de signaux ultérieure entraîne la prolifération des cellules 9. Des mutations conduisant à l&#39;expression de l&#39;EGFR ou activité anormale jouent un rôle central dans de nombreux types de cancer 10. StudyIng l&#39;agencement spatial de ce récepteur membranaire dans des cellules entières de contexte fournit des informations importantes sur sa fonction d&#39;éventuelles modifications de ceux-ci et de 11 à 14. Mais il reste difficile de sonder la répartition des monomères de l&#39;EGFR, dimères, et les grappes directement sur ​​un niveau (sous-) cellulaire avec des méthodes de microscopie biochemical- ou conventionnelles 15. Notre méthode est capable de visualiser EGFR avec une résolution spatiale de quelques nanomètres telles que la localisation des protéines dans un complexe peut être déterminée. Plus important encore, les informations obtenues sur la distribution stoechiométrique se rapporte à la situation native de la protéine dans la cellule intacte. Afin de parvenir à une courte distance entre l&#39;étiquette et le récepteur, l&#39;EGFR a été directement marqué par son ligand EGF, à l&#39;aide d&#39;une liaison biotine-streptavidine à une QD. Ce marqueur peut être détecté par microscopie par fluorescence à la fois et électrons. Nous avons utilisé cette étiquette pour l&#39;imagerie corrélative des cellules COS7 enliquide enfermé dans une chambre microfluidique précédemment 1,16,17. Cependant, en raison d&#39;un multiple de streptavidine molécules par QD, cette étiquette peut induire le regroupement des récepteurs, conduisant à une efficacité de marquage faible ou expériences plutôt coûteux, et il est impossible de conclure sur la stoechiométrie de la protéine sous enquête. Regroupement des récepteurs induite Label peut être évitée en utilisant la procédure d&#39;étiquetage en deux étapes présentée ici, résultant en une sonde comprenant EGF biotinylé à laquelle une seule streptavidine-points quantiques (STR-QD) est couplé. Les cellules sont d&#39;abord incubées avec EGF biotinylé, puis fixées. L&#39;étape de fixation détermine le point à partir duquel les processus de protéines sont arrêtés (en fonction de la vitesse de la fixation) de temps. STR-QD est appliquée par la suite en tant que deuxième étape du protocole de marquage. Clustering n&#39;a pas lieu puisque le mouvement de la membrane dynamique des protéines est encombrée lorsque les protéines sont fixés. En outre, la solution STR-QD, qui est leplus coûteux composant de l&#39;expérience, peut être appliquée dans une faible concentration optimisée, et cette deuxième étape de marquage est pas cruciale temps, à savoir la QD peut être couplé à plusieurs minutes. Pour étudier la stoechiométrie de l&#39;EGFR tel que distribué dans des cellules entières, des échantillons cellulaires ont été préparés sur des micropuces de silicium 18. Après l&#39;application de l&#39;étiquetage de QD en deux étapes, et l&#39;enregistrement d&#39;images de microscopie par fluorescence, les cellules ont été rincées avec de l&#39;eau pure, et imagés en état ​​hydraté en utilisant ESEM-STEM 19. Les images corrélatifs résultant fournissent des informations sur la distribution de l&#39;EGFR cellulaire, et la stoechiométrie dans leur contexte naturel des cellules hydratées. Une méthode similaire a été utilisée pour étudier les protéines HER2 dans les cellules du cancer du sein dans une étude récente 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>AF6000 + DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESEM</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td>Quanta 400 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstripper</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>25-056 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, chromasolv Plus for HPLC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1058.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Rotisolv HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>O163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7041-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shoul</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>E3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium teraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 800 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10173MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon microchips with silicon nitride membranes</td>
			<td>DENS Solutions</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>of 50 nm thickness and dimensions of 50 &#181;m x 0.40 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy

Ce protocole décrit le marquage du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) sur des cellules de fibroblastes COS7, et après la microscopie par fluorescence et par microscopie corrélative électronique à balayage environnemental (ESEM) de cellules entières à l&#39;état hydraté. Les points quantiques (QD fluorescents) ont été couplés à l&#39;EGFR par un protocole de marquage en deux étapes, fournissant une protéine de marquage spécifique et efficace, tout en évitant le regroupement induite étiquette du récepteur. La microscopie à fluorescence a fourni des images aperçu des emplacements cellulaires de l&#39;EGFR. Le détecteur microscopie électronique en transmission à balayage (STEM) a été utilisé pour détecter les étiquettes QD avec une résolution nanométrique. Les images résultantes fournissent des données corrélatives de la distribution cellulaire de l&#39;EGFR, et la stoechiométrie à l&#39;échelle moléculaire unique dans le contexte naturel de la cellule intacte hydraté. Images ESEM-STEM a révélé le récepteur d&#39;être présent en tant que monomère, comme homodimère, et en petites grappes. Étiquetage avec deux points quantiques différents,soit un émettant à 655 nm et à 800 révélé des résultats caractéristiques similaires.

La figure 1 et 2 illustrent des images représentatives de QD655 marqué, EGFR lié à la membrane dans visualisées intactes, des cellules COS-7 entièrement hydratées cellules. L&#39;image DIC sur la figure 1 une donne une impression de la topographie de la membrane des cellules, et l&#39;image de fluorescence correspondant à la figure 1b montre la répartition de l&#39;EGFR après 3 min de EGF-biotine incubation. La figure 1A et B sont chacun cousues ensemble de deux les images enregistrées avec un objectif de l&#39;air 40X. L&#39;EGFR activé EGF est répartie sur toute la surface cellulaire. Dans la plupart des cellules une légère amélioration de la fluorescence (figure 1B) peut être vu sur les bords de la cellule, indiquant une présence accrue de l&#39;EGFR au niveau local 20. Des expériences témoins effectuées en utilisant un protocole similaire dignes de confiance marquage spécifique de l&#39;EGFR (données non présentées). Ces contrôles suivants: 1) un marquage témoin sans incubation préalable de la CELLS avec EGF-biotine, à savoir, que l&#39;incubation avec STR-QD, et 2) une incubation avec des non-biotinylé EGF et STR-QD. Les trois cellules marquées avec des rectangles ont été étudiés plus avec ESEM-STEM. Les images ESEM-SOUCHES représentées sur la figure 1C - E présentent de faibles aperçus d&#39;agrandissement de ces cellules. Ces images de transmission reflètent cellules entières dans un état hydraté avec mince couche d&#39;eau résidant sur la cellule placée sur une puce de silicium avec du nitrure de silicium (SiN) fenêtre de visualisation. La chambre à vide à la vapeur d&#39;eau contenue au microscope, et l&#39;équilibre entre la température et la pression échantillon a été ajusté à maintenir une mince couche de liquide sur les cellules. Les cellules individuelles peuvent être facilement reconnus en raison de leur forme et l&#39;emplacement de la fenêtre de la membrane SiN. Les images ESEM-SOUCHES faible grossissement révèlent des structures fines, comme filopodia, partant du bord de la cellule vers les cellules voisines, et certaines structuresà l&#39;intérieur des régions cellulaires plus fines. Régions cellulaires centrale épaisse dont le noyau apparaissent en blanc parce que la transmission à travers l&#39;échantillon est pas possible pour des électrons de l&#39;énergie utilisée (30 keV). Haute résolution images ESEM-STEM ont été enregistrées dans les régions périphériques, plus minces. La résolution spatiale pour ESEM-STEM de nanoparticules dans les régions minces de cellules dans une fine couche de liquide a été déterminée dans une étude précédente de 6 à élever à 3 nm. Quatre images haute résolution présentés dans la figure 2A - D ont été enregistrés à l&#39;emplacement des petits rectangles de la figure 1C - E. Le grossissement utilisé était suffisante pour discerner les points quantiques individuels, apparaissant, tiges en forme de balles que lumineuses, chacune liée à un individu EGFR. Le QD655 a des dimensions typiques de 6 x 14 nm 2. La figure 2A (correspondant à la zone rectangulaire indiqué sur la cellule dans Figure 1C) montre étiquettes QD sur une membrane replient diagonale traversant l&#39;image. Cette structure de membrane a une densité supérieure à celle de l&#39;EGFR les régions entourant la membrane. À plusieurs endroits, deux étiquettes étaient à proximité. Deux exemples avec des distances de 20 et 24 nm sont indiquées par des flèches. Ces paires d&#39;étiquettes sont interprétés comme appartenant à des dimères de l&#39;EGFR. La figure 2B montre un exemple par rapport au bord d&#39;une cellule (figure 1D, le rectangle à gauche), les monomères de l&#39;EGFR et de dimères peuvent être regardé aussi. La figure 2C (figure 1C, le rectangle à droite) a été enregistré d&#39;une région avec un signal de fluorescence plus faible, à savoir, la densité de l&#39;EGFR inférieur. Néanmoins, l&#39;EGFR a également été trouvé ici, dans dimères ainsi. En outre, deux groupes de 10 ou 11 EGFR étaient présents (voir ellipses). Figure 2D montre un autre exemple d&#39;un pli de la membrane (figure 1E) avec de petites grappes, y compris 5-6 EGFR, en plus de plusieurs monomèreset dimères. Comme un exemple du genre d&#39;information qui peut être obtenu à partir de ces données, la paire fonction de corrélation 21 g (x) a été déterminée pour tous les postes de l&#39;étiquette de la figure 2. Notez que cette analyse ne fait pas partie de ce protocole et la procédure a été décrite ailleurs 6,7. g (x) est une mesure de la probabilité d&#39;une particule se trouve à une certaine distance radiale à partir d&#39;une particule x de référence. g (x) = 1 représente une distribution aléatoire, et une valeur plus grande est la preuve pour le clustering. Les positions d&#39;un total de 210 étiquettes ont été automatiquement détectés dans les quatre images de la figure 2A-D, et g (x) a été calculée en utilisant une taille de bin de 5 nm et un filtre de lissage avec une largeur de bande de 10 nm. La courbe g (x) (figure 3) montre un centre à centre QD distance préférée de 25 nm. EGFR ne sont donc pas orientées de manière aléatoire, mais une fraction notable de leur réside à cette distance préférée. D&#39;un approximatmodèle moléculaire e 6 (figure 3 en médaillon), nous estimons que la distance de centre à centre entre le QD et la poche de liaison EGF revient à ~ la distance 14 nm, et de centre à centre entre les deux points quantiques attachés à un dimère de l&#39;EGFR à ~ 27 nm être (cette valeur est susceptible de varier par quelques nanomètres raison de la flexibilité du lieur). La distance d&#39;étiquette préféré est donc compatible avec la distance de l&#39;étiquette prévue pour le dimère de l&#39;EGFR à l&#39;intérieur de la précision de la méthode. Le g (x) est courbe supérieur à l&#39;unité pour la distance maximale de 300 nm, indiquant la présence de groupements, cohérent avec les données. Cette analyse montre que la stoechiométrie de l&#39;EGFR peut être étudié avec notre procédé. La figure 4 montre un résultat similaire à la Figure 2, sauf que le marquage a été réalisé avec EGF-QD800, et un objectif 63X à immersion d&#39;huile a été utilisée pour l&#39;image de fluorescence. Ces données confirment que ces résultats typiques sont également présents lorsquel&#39;étiquetage de l&#39;EGFR se fait avec les points quantiques, qui émettent dans le spectre proche rouge. La figure 4A est l&#39;image de fluorescence d&#39;une cellule représentative, la figure 4B montre la même cellule en mode aperçu ESEM-STEM et la figure 4C est une image de grossissement 150.000 x, enregistré à la frontière de la membrane supérieure de la cellule (voir le rectangle dans la figure 4B). Similaire à la figure 2A et D, les images saisissent EGFR QD marqué sur un pli de la membrane et montre récepteurs monomères, dimères, et en grappes. Notez que l&#39;électron noyau QD dense apparaît un peu plus petite et plus ronde que les noyaux des boîtes quantiques émettant à 655 nm, compatible avec leur petite taille du noyau de 22 ~ 5 nm. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> Figure 1. corrélative DIC, fluorescence et ESEM-STEM d&#39;EGF-QD655 étiqueté EGFR sur COS-7 entièrement hydratés cellules </stRong&gt;. image (A) DIC des cellules cultivées sur la zone de la fenêtre de la membrane péché, donnant une impression topographique de la membrane plasmique. (B) l&#39;image de fluorescence montrant des cellules sur la fenêtre de la membrane de SiN situé au centre (marqué par le rectangle en pointillés). (C - E) Trois ESEM-SOUCHES faible grossissement des images des cellules marquées avec des rectangles dans A et B. Ces images vue d&#39;ensemble de la cellule servent à déterminer l&#39;emplacement précis des images enregistrées ultérieurement à haute résolution. L&#39;emplacement de quatre images à haute résolution (Figure 2A-D) sont marqués par des rectangles blancs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <strong&gt; Figure 2. haute résolution des images ESEM-SOUCHES représentant membranaires EGFR. (A) Microscopie à 75,000X agrandissement de la zone marquée dans la figure 1B. Beaucoup de monomères sont visibles. Plusieurs dimères sont indiqués par les flèches. (C) des images acquises à 50,000X grossissement de gauche (B) et, respectivement, les zones membranaires marqués à droite sur la figure 1C. Des grappes de EGFR sont décrites. L&#39;image (D) enregistré avec 50,000X grossissement à l&#39;emplacement marqué à la figure 1D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> Figure 3. Paire fonction de corrélation g (x) en tant que fonction de la distance radiale x déterminée pour l&#39;inter-parti<html> distances CLE de toutes les 210 étiquettes détectés à la figure 2A-D. Le pic à 25 nm indique qu&#39;un QD distance de centre-à-centre a beaucoup plus de chances de se produire que aléatoire, lequel ag (x) = 1 indique un hasard. La ligne en pointillé est un guide à l&#39;œil représentant g (x) d&#39;une distribution aléatoire. L&#39;encart montre un modèle moléculaire approximatif du dimère de l&#39;EGFR avec EGF lié et revêtues de streptavidine QDs fixés par l&#39;intermédiaire de la biotine. Les modèles de la streptavidine, l&#39;EGF et le EGFR ont été obtenus à partir de modèles de CPK du 1stp (streptavidine), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, structures du RCSB Protein Protein Databank, créé par Jmol Version 1IVO et 2GS6 (EGFR) 12.2.15. Le modèle de la biotine est aussi dessiné dans RCSB Ligand Explorer version 1.0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. exemplaire COS-7 cellules marquées avec de l&#39;EGF-QD800 et imagé avec fluorescence corrélative et ESEM-STEM. (A) image de fluorescence, (B) faible aperçu de grossissement d&#39;image ESEM-STEM. (C) de l&#39;image à haute résolution enregistrée à l&#39;emplacement du rectangle en b au 150,000X grossissement. EGFR monomères, dimères, et en grappes sont détectés similaire à l&#39;étiquetage avec EGF-QD655. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

L&#39;étude de la Stœchiométrie Epidermal Growth Factor Receptor dans des cellules intactes en utilisant la microscopie corrélative

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K vues.  INM-Leibniz Institute for New Materials. This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level. 

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Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

Etudier Trajectoires Cellule roulant sur les Patterns récepteur asymétrique

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Recherche

Bio-ingénierie

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Croissance stretch Axon: La mécanotransduction de croissance neuronale

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Livraison de gènes et transfection de cellules humaines de cancer du pancréas en utilisant facteur de croissance épidermique ciblant les récepteurs des base de gélatine nanovecteurs Conçu

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopie corrélative pour l&#39;analyse structurale 3D des interactions dynamiques

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Microinjection plaies dosage et<em&gt; In vivo</em&gt; Localisation des épidermique plaies Reporters réponse dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Électrofilage facteur de croissance libération de microsphères en fibre échafaudages

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Complexe de polyélectrolyte pour Heparin Binding Domain Growth Factor ostéogénique Livraison

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein (HDL)-mimicking nanoparticles (NPs). HDLs are endogenous NPs and have been explored as vehicles for the delivery of therapeutic agents. Various methods have been developed to prepare HDL-mimicking NPs. However, they are generally complicated, time consuming, and difficult for industrial scale-up. In this study, one-step homogenization was used to mix the excipients and form the prototype NPs. NGF is a water-soluble protein of 26 kDa. To facilitate the encapsulation of NGF into the lipid environment of HDL-mimicking NPs, protamine USP was used to form an ion-pair complex with NGF to neutralize the charges on the NGF surface. The NGF/protamine complex was then introduced into the prototype NPs. Apolipoprotein A-I was finally coated on the surface of the NPs. NGF HDL-mimicking NPs showed preferable properties in terms of particle size, size distribution, entrapment efficiency, in vitro release, bioactivity, and biodistribution. With the careful design and exploration of homogenization in HDL-mimicking NPs, the procedure was greatly simplified, and the NPs were made scalable. Moreover, various challenges, such as separating unloaded NGF from the NPs, conducting reliable in vitro release studies, and measuring the bioactivity of the NPs, were overcome.

Simple homogenization was used to prepare novel, high-density, lipoprotein-mimicking nanoparticles to encapsulate nerve growth factor. Challenges, detailed protocols for nanoparticle preparation, in vitro characterization, and in vivo studies are described in this article.

Préparation et caractérisation de nouvelles nanoparticules imitant HDL pour l&#39;encapsulation du facteur de croissance nerveuse

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...