Alessandra d’Azzo est titulaire de la chaire de génétique et de thérapie génique de Jewelers for Children (JFC). Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du NIH R01GM104981, RO1DK095169 et CA021764, la Fondation Assise de Memphis et l’American Lebanese Syrian Associated Charities.

Toutes les procédures chez la souris ont été effectuées selon des protocoles sur les animaux approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital de recherche pour enfants St. Jude et les directives des National Institutes of Health.
1. Préparation des solutions et des milieux
<ol><li>Préparer la solution de digestion en mélangeant 15,4 mL de PBS avec 2,5 mL de collagénase P à 20 mg/mL (concentration finale de 5 mg/mL), 2 mL de dispase II à 11 U/mL (concentration finale de 1,2 U/mL) et 100 μL de CaCl2 à 1,0 M (concentration finale de 5 mM).</li>
	<li>Préparer 500 mL de milieu de fibroblastes primaires (DMEM complet) en mélangeant 440 mL de DMEM avec 50 mL de FBS (10 %), 5,0 mL de stylo/streptocoque (100 U/mL et 100 μg/mL, respectivement) et 5,0 mL de supplément de glutamine (2 mM). Filtrez et stérilisez le milieu à l’aide d’un filtre à vide de 0,22 μm.</li>
	<li>Préparer le sérum exempt d’exosomes par ultracentrifugation de FBS pendant la nuit dans des tubes en polypropylène de 38,5 mL à 100 000 x g à 4 °C et transférer le surnageant dans un nouveau tube.</li>
	<li>Préparez 500 mL de milieu exempt d’exosomes en mélangeant 440 mL de DMEM avec 50 mL de sérum sans exosomes (10 %), 5 mL de stylo/streptocoque (100 U/mL et 100 μg/mL) et 5 mL de supplément de glutamine (2 mM). Filtrez et stérilisez le milieu à l’aide d’un filtre à vide de 0,22 μm.</li>
	<li>Préparer 0,5 M de Tris-HCl (pH 7,4) en dissolvant 6,057 g de base de Tris dans 90 mL de dH 2 O et en ajustant le pH à 7,4 avec HCl. Régler le volume à 100 mL avec dH2O.</li>
	<li>Préparer une solution de 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM de Mg(Ac)2 (solution de travail du saccharose) en mélangeant 97,9 mL de dH 2 Oavec 2 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH = 7,4) et 100 μL de 1 M Mg(Ac)2. Ajoutez des inhibiteurs de protéase à la solution juste avant l’utilisation et conservez la solution sur de la glace.</li>
	<li>Préparer des solutions de gradient de densité de saccharose sur de la glace conformément au tableau 1. Ces solutions sont suffisantes pour préparer deux tubes de gradient de saccharose.</li>
	<li>Préparez 100 % de TCA en ajoutant 40 mL de dH2O à 100 g de poudre de TCA et mélangez jusqu’à dissolution complète. Réglez le volume final avec dH2O à 100 mL.</li>
	<li>Préparer de l’éthanol à 80 % en mélangeant 20 mL de dH2O avec 80 mL d’éthanol à 100 %.</li>
	<li>Préparer le tampon de Western Blot en mélangeant 1,8 L de dH2O avec 200 mL de tampon de fonctionnement 10x.</li>
	<li>Préparer le tampon de transfert Western Blot en mélangeant 1,4 L de dH2O avec 200 mL de tampon de transfert 10x et 400 mL de méthanol. Prérefroidir le tampon de transfert à 4 °C.</li>
	<li>Préparer 20 fois une solution saline tamponnée Tris (TBS) en dissolvant 122 g de base Tris et 180 g de chlorure de sodium dans 850 mL de dH2O (pH 8,0). Réglez le volume à 1 L avec dH2O.</li>
	<li>Préparer le tampon de blocage en dissolvant 5 g de lait écrémé en poudre avec 1 mL de Tween-20 à 10 %, 5 mL de 20x TBS et 94 mL de dH2O.</li>
	<li>Préparer le tampon d’anticorps en dissolvant 3 g de BSA avec 1 mL de Tween-20 à 10 %, 5 mL de 20x TBS et 94 mL de dH2O.</li>
	<li>Préparer le tampon de lavage en mélangeant 100 mL de 20x TBS et 20 mL de 10% Tween-20 (10x) avec 1,88 L de dH2O.</li>
	<li>Préparer la solution de développement en mélangeant 1 volume de luminol/enhance avec 1 volume de tampon de peroxyde stable.</li>
</ol>2. Dissection du muscle gastrocnémien (GA) de la souris15,16
<ol><li>Préparer des tubes de 50 ml contenant 10 ml de PBS sur glace.</li>
	<li>Euthanasier les souris dans une chambre de CO2 suivie d’une luxation cervicale.</li>
	<li>Retirez le muscle gastrocnémien des deux jambes et transférez-les dans le tube avec PBS sur glace. REMARQUE : Retirez le muscle soléaire du muscle GA avant de transférer le muscle GA au PBS.</li>
</ol>3. Isolement et culture de fibroblastes primaires de souris
<ol><li>Pesez les muscles et transférez-les dans un plat de 10 cm sous une hotte de biosécurité. Hachez les muscles avec des scalpels jusqu’à ce qu’ils deviennent une pâte fine.</li>
	<li>Transférez la pâte musculaire finement hachée dans un tube de 50 mL et ajoutez 3,5 fois le volume/mg de tissu de solution de digestion dans le tube et incubez pendant 45 min à 37 °C. Bien mélanger la suspension à l’aide d’une pipette de 5 ml toutes les 10 minutes (cela facilitera la dissociation complète). REMARQUE : Alternativement, un dissociateur tissulaire peut être utilisé pour cette étape.</li>
	<li>Ajouter 20 mL de DMEM complet à la suspension cellulaire pour inactiver la solution de digestion. Transférer dans une crépine en nylon de 70 μm placée sur un tube de 50 ml. Recueillir l’écoulement et laver la crépine cellulaire avec 5 mL supplémentaires de DMEM complet.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g à température ambiante (RT) pendant 10 min et retirer délicatement le surnageant.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de DMEM complete et ensemencer les cellules dans une boîte de 10 cm.</li>
	<li>Cultiver les cellules à 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O2 (passage 0 ou P0). REMARQUE : 1) Ces cultures doivent être maintenues à un faible niveau d’oxygène pour garantir des conditions physiologiques similaires (le niveau d’O 2 dans le muscle squelettique est d’environ2,5 %)17. 2) Le numéro de passage (p. ex., P0) d’une culture cellulaire est un enregistrement du nombre de fois où la culture a été sous-cultivée. 3) Les fibroblastes primaires à P0 sont systématiquement cultivés jusqu’à 100% de confluence plus 1 jour (et seulement pour P0). Il s’agit de purger d’autres types de cellules et de s’assurer que les cellules présentes dans la culture ne sont que des fibroblastes, appauvris en cellules myogéniques sur la base d’un examen au microscope. Le muscle squelettique d’un animal adulte à l’âge de 2 mois contient environ 2 % de progéniteurs myogéniques4. De plus, les progéniteurs myogéniques ne se fixent généralement pas aux plats non enrobés ; Par conséquent, ils sont perdus lors de la sous-culture18,19,20. Les cellules myogéniques ont besoin d’un milieu différent (F10) complété par 20 % de FBS et de facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)18. Dans le DMEM complet, les fibroblastes moyens ont un taux de prolifération plus élevé que les cellules myogéniques, ce qui entraîne l’élimination de ces cellules contaminantes avant le premier passage.</li>
	<li>Rincez les cellules P0 avec du PBS lorsqu’elles sont confluentes à 100 % plus 1 jour. Ajouter 1 mL de solution de trypsinisation et incuber à 37 °C, 5 % de CO 2, 3 % d’O2 pour détacher les cellules. Arrêtez l’activité enzymatique en utilisant 10 mL de DMEM complet.</li>
	<li>Centrifuger les alvéoles à 300 x g pendant 10 min à RT et remettre en suspension la pastille dans 20 mL de DMEM complet et semer dans un plat de 15 cm (passage 1 ou P1). Les cellules sont cultivées jusqu’à 80 % à 90 % de confluence et peuvent être étendues jusqu’au passage 3. NOTE : Selon les expériences en aval, le passage 1, le passage 2 (P2) ou le passage 3 (P3) peuvent être utilisés.</li>
</ol>4. Ensemencement des cellules et collecte du milieu conditionné
<ol><li>Laver les fibroblastes (P1, P2 ou P3) avec 10 mL de PBS, ajouter 2,5 mL de solution de trypsinisation aux cellules et incuber à 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O2. Arrêtez l’activité enzymatique en utilisant 10 mL de DMEM complet. REMARQUE : Après le passage 4, les cellules primaires sont jetées et ne doivent pas être utilisées pour d’autres expériences, car elles changent de caractéristiques.</li>
	<li>Recueillir les cellules et centrifuger à 300 x g à RT pendant 10 min.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu exempt d’exosomes et compter les cellules.</li>
	<li>Ensemencer les cellules à raison de 1,5–2,0 x 106 cellules par boîte (15 cm) et incuber à 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O2.</li>
	<li>Recueillir le milieu conditionné entre 16 et 24 h dans des tubes de 50 ml sur de la glace. REMARQUE : Si les cellules ne sont pas confluentes à 80 %, un milieu libre exosomal frais peut être ajouté à nouveau et recueilli après une période supplémentaire de 16 à 24 h. Les deux collections peuvent être combinées pour un traitement ultérieur.</li>
</ol>5. Purification des exosomes par centrifugation différentielle et ultra-centrifugation
REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à 4 °C ou sur de la glace. Équilibrez le tube avec un tube rempli d’eau si nécessaire.
<ol><li>Centrifuger le milieu conditionné à 300 x g pendant 10 min pour éliminer les cellules vivantes et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL.</li>
	<li>Éliminer les cellules mortes par centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min et transférer le surnageant dans un tube en polypropylène de 38,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant à 10 000 x g pendant 30 min pour l’élimination des organites, des corps apoptotiques et des fragments de membrane. Transvaser le surnageant dans un tube ultra-transparent de 38,5 ml.</li>
	<li>Ultracentrifuger le surnageant à 100 000 x g pendant 1,5 h pour granuler les exosomes.</li>
	<li>Jetez soigneusement le surnageant, en laissant environ 1 mL de milieu conditionné, et lavez la pastille d’exosome dans un volume total de 30 mL de PBS glacé.</li>
	<li>Centrifuger à 100 000 x g pendant 1,5 h et éliminer soigneusement le surnageant par pipetage, en veillant à ne pas perturber la pastille exosomale.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans du PBS glacé (~25 μL par plat de 15 cm) et mesurer la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines BCA et d’un lecteur de microplaques à 562 nm. REMARQUE : La concentration en protéines est mesurée par une dilution 1 :2 avec 0,1% de Triton-X100 dans dH2O. Le rendement des exosomes d’une boîte de 15 cm (20 mL de milieu conditionné) de fibroblastes primaires à 80 % de confluence est de ~3–4 μg.</li>
</ol>6. Caractérisation des exosomes par gradient de densité de saccharose
<ol><li>Charger le gradient de saccharose dans un tube ultra-clair de 13 mL en pipetant (de bas en haut) les éléments suivants : 1,5 mL de 2,0 M, 2,5 mL de 1,3 M, 2,5 mL de 1,16 M, 2,0 mL de 0,8 M et 2,0 mL de solutions de saccharose 0,5 M.</li>
	<li>Mélangez 30 à 100 μg d’exosomes avec une solution de saccharose à 0,25 M et ajustez le volume à 1 mL.</li>
	<li>Chargez soigneusement les exosomes au-dessus des gradients et ultra-centrifugez les échantillons pendant 2,5 h à 100 000 x g et 4 °C.</li>
	<li>Retirez les tubes de l’ultra-centrifugeuse et placez-les sur de la glace et collectez des fractions de 1,0 ml en commençant par le haut du gradient. Transférez-les dans des tubes de 1,7 ml sur de la glace.</li>
	<li>Ajouter 110 μL de TCA à 100 % dans chaque tube, bien mélanger et incuber pendant 10 min à RT.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g et RT et jeter soigneusement le surnageant.</li>
	<li>Remettre le granulé en suspension dans 500 μL d’éthanol 80 % pré-refroidi et laisser les échantillons à laver pendant 10 min à -20 °C.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g et 4 °C et jeter le surnageant.</li>
	<li>Séchez la pastille pendant 10 à 15 minutes à RT et remettez-la en suspension dans du PBS pour des expériences in vitro. Mesurer la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA ou remettre la pastille en suspension directement dans 14,5 μL de dH2O, 5 μL de tampon Laemmli 4x et 0,5 μL de DTT 1 M pour les analyses par transfert Western.</li>
</ol>7. Détection d’exosomes par Western blot
<ol><li>Mélanger 5 à 10 μg d’exosomes de l’étape 5.7 avec 5 μL de tampon Laemmli 4x et 0,5 μL de DTT 1 M, puis ajuster le volume final à 20 μL avec dH2O. Chauffer tous les échantillons, y compris ceux de l’étape 6.9, pendant 5 min à 98 °C.</li>
	<li>Chargez les échantillons dans un gel anti-taches TGX à 10 % et chargez les échelles de protéines selon les recommandations du fabricant. REMARQUE : Choisissez le pourcentage du gel en fonction du poids moléculaire de la protéine d’intérêt.</li>
	<li>Faire fonctionner le gel à 100 V pendant ~1 h dans le tampon de fonctionnement jusqu’à ce que le colorant de charge se trouve au fond du gel. REMARQUE : La durée d’exécution peut varier en fonction de l’équipement utilisé ou du type et du pourcentage de gel.</li>
	<li>Imagez le gel. Les images des gels sans taches sont utilisées comme contrôle de la charge pour les immunoblots.</li>
	<li>Transférer le gel à l’aide d’une membrane PVDF pendant 1,5 h à 80 V ou toute la nuit à 30 V à 4 °C.</li>
	<li>Bloquer les membranes dans le tampon de blocage pendant 1 h à RT.</li>
	<li>Incuber les membranes pour des anticorps spécifiques (tableau 2) dans un tampon d’anticorps pendant une nuit à 4 °C avec agitation.</li>
	<li>Laver les membranes dans un tampon de lavage et incuber les membranes avec les anticorps secondaires appropriés (tableau 2) pendant 1 h à RT avec agitation.</li>
	<li>Lavez les membranes dans un tampon de lavage et imagez les membranes à l’aide d’une solution de développement et d’un imageur basé sur une caméra. Vous pouvez également utiliser un film radiographique pour développer les membranes.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Extracellular+Vesicles,+Their+Origin,+Composition,+Purpose,+and+Methods+for+Exosome+Isolation+and+Analysis.">Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Isolation,+Characterization,+Biological+Function,+and+Multifarious+Therapeutic+Approaches+of+Exosomes.">Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.</a> Cells. 8 (4), 307 (2019).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. 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Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Une étape cruciale pour l’isolement réussi des exosomes des milieux de culture, telle que décrite dans ce protocole, est l’établissement et le maintien appropriés de cultures primaires de fibroblastes de souris à partir du muscle squelettique adulte. Ces cultures doivent être maintenues à un faible niveau d’oxygène pour garantir des conditions physiologiques similaires (le niveau d’O2 dans le muscle squelettique est de ~2,5 %)15. Les fibroblastes primaires changeront de...

Les exosomes sont des vésicules extracellulaires hétérogènes dont la taille varie de 30 à 150 nm. Ils sont des acteurs clés établis dans les processus physiologiques et pathologiques, étant donné leur distribution omniprésente dans les tissus et les organes 1,2. Les exosomes transportent une cargaison complexe de protéines, de lipides, de types d’ADN et de types d’ARN, qui varient selon le type de cellules dont ils sont dérivés 1,2,3. Les exosomes sont enrichis en protéines qui ont des fonctions différentes (c’est-à-dire que les tétraspanines, y compris CD9 et CD63) sont responsables des événements de fusion. Par exemple, les protéines de choc thermique HSP70 et HSP90 sont impliquées dans la liaison et la présentation de l’antigène. De plus, Alix, Tsg101 et la flottilline participent à la biogenèse et à la libération des exosomes et sont largement utilisés comme marqueurs de ces nanovésicules 2,3,4.
Les exosomes contiennent également une variété d’ARN (c’est-à-dire des microARN, de longs ARN non codants, des ARN ribosomiques) qui peuvent être transférés aux cellules réceptrices, où ils influencent la signalisation en aval3. Étant entourés d’une seule unité de membrane, la bioactivité des exosomes dépend non seulement de la cargaison de protéines et d’acides nucléiques, mais aussi des composants lipidiques de la membrane limitante1. Les membranes exosomiques sont enrichies en phosphatidylsérine, en acide phosphatidique, en cholestérol, en sphingomyéline, en acide arachidonique et en autres acides gras, qui peuvent tous influencer la stabilité des exosomes et la topologie membranaire 2,3. En raison de l’arrangement de la cargaison et des lipides, les exosomes initient des voies de signalisation dans les cellules réceptrices et participent au maintien d’une physiologie tissulaire normale 1,2,4,5. Dans certaines conditions pathologiques (c’est-à-dire la neurodégénérescence, la fibrose et le cancer), il a été démontré qu’ils déclenchent et propagent des stimuli pathologiques 4,6,7,8,9,10,11.
En raison de leur capacité à propager des signaux à des sites voisins ou éloignés, les exosomes sont devenus des biomarqueurs précieux pour le diagnostic ou le pronostic des maladies. De plus, les exosomes ont été utilisés expérimentalement comme véhicules de composés thérapeutiques 2,12. L’application potentielle de ces nanovésicules en clinique rend la méthode d’isolement de plus en plus importante afin d’obtenir un rendement, une pureté et une reproductibilité maximum. Différentes techniques d’isolement des exosomes ont été développées et mises en œuvre. En général, les exosomes peuvent être isolés à partir de milieux de culture cellulaire conditionnés ou de fluides corporels par centrifugation différentielle, chromatographie d’exclusion de taille et capture immunitaire (à l’aide de kits disponibles dans le commerce). Chaque approche présente des avantages et des inconvénients uniques qui ont été discutés précédemment 1,2,13,14.
Le protocole décrit se concentre sur 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir de muscles gastrocnémiens de souris adultes et 2) la purification et la caractérisation des exosomes libérés dans le milieu de culture par ces cellules. Il n’existe actuellement pas de protocole bien établi pour l’isolement des exosomes des fibroblastes primaires dans le cadre d’études fonctionnelles. Les fibroblastes primaires ne sécrètent pas de grandes quantités d’exosomes, ce qui rend le processus d’isolement et de purification difficile. Ce protocole décrit la purification de grandes quantités d’exosomes purs à partir de grands volumes de culture tout en maintenant leur intégrité morphologique et leur activité fonctionnelle. Des exosomes purifiés obtenus à partir d’un milieu conditionné ont été utilisés avec succès dans des expériences d’absorption in vitro pour induire des voies de signalisation spécifiques dans les cellules réceptrices. Ils ont également été utilisés pour des analyses protéomiques comparatives de cargaisons exosomiques provenant de plusieurs échantillons biologiques4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific, TPP</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620659/5427754008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>11 213 857 001</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Millipore/Sigma, Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion Blotter with plate electrodes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX stain-free protein gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5678034</td>
			<td>10% 18-well, midi-gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion vertical electrophoresis cell (midi)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>NC0165100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>04 942 078 001</td>
			<td>neutral protease, grade II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma/Millipore, Roche</td>
			<td>10708984001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification Eagles Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluostar Omega multi-mode microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63052-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>LabScientific</td>
			<td>M-0842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2/CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MC0-18M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td>
			<td>AVSC1510</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected disposable scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer (70 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher brand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal west Femto</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>16110734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge Optima XPM</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tube (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tubes (25x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Isotemp 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts

Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires libérées par pratiquement toutes les cellules et sécrétées dans tous les fluides biologiques. De nombreuses méthodes ont été développées pour l’isolement de ces vésicules, notamment l’ultracentrifugation, l’ultrafiltration et la chromatographie d’exclusion de taille. Cependant, tous ne sont pas adaptés à la purification et à la caractérisation des exosomes à grande échelle. Voici un protocole pour l’établissement de cultures de fibroblastes primaires isolés à partir de muscles squelettiques de souris adultes, suivis de la purification et de la caractérisation des exosomes à partir des milieux de culture de ces cellules. La méthode est basée sur l’utilisation d’étapes de centrifugation séquentielles suivies de gradients de densité de saccharose. La pureté des préparations exosomiques est ensuite validée par des analyses par transfert Western à l’aide d’une batterie de marqueurs canoniques (c’est-à-dire Alix, CD9 et CD81). Le protocole décrit comment isoler et concentrer des exosomes bioactifs pour la microscopie électronique, la spectrométrie de masse et les expériences d’absorption pour les études fonctionnelles. Il peut facilement être mis à l’échelle ou réduit et adapté pour l’isolement d’exosomes à partir de différents types de cellules, de tissus et de fluides biologiques.

Ce protocole est adapté à la purification d’exosomes à partir de grands volumes de milieu conditionné de manière rentable. La procédure est hautement reproductible et cohérente. La figure 1 montre une image de microscopie électronique à transmission (MET) d’exosomes purifiés à partir du milieu de culture de fibroblastes primaires de souris. La figure 2 montre le profil d’expression protéique des marqueurs exosomaux canoniques et l’absence de ...

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Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Ce protocole illustre 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir du muscle gastrocnémien de souris adulte ainsi que 2) la purification et la caractérisation des exosomes à l’aide d’une méthode d’ultracentrifugation différentielle combinée à des gradients de densité de saccharose suivis d’analyses par western blot.

Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

isolation-characterization-exosomes-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

3.2K vues.  St. Jude Children's Research Hospital. Ce protocole illustre 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir du muscle gastrocnémien de souris adulte ainsi que 2) la purification et la caractérisation des exosomes à l’aide d’une méthode d’ultracentrifugation différentielle combinée à des gradients de densité de saccharose suivis d’analyses par western blot.

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Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adultes et embryonnaires Culture squelettique Microexplant musculaire et isolement de cellules souches du muscle squelettique

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Recherche

Biologie

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolement mitochondriale du muscle squelettique

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purification des progéniteurs du muscle squelettique

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolement et caractérisation de l&#39;ARN-Contenant exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolement et caractérisation des fibroblastes cardiaques adultes et des myofibroblastes

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

Isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains des tranches myocardales vibratoires-cut

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Methods Article

Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques