Alessandra d'Azzo, Genetik ve Gen Terapisinde Çocuklar için Kuyumcular (JFC) Bağış Kürsüsüne sahiptir. Bu çalışma kısmen NIH hibeleri R01GM104981, RO1DK095169 ve CA021764, Memphis Assisi Vakfı ve Amerikan Lübnan Suriye İlişkili Hayır Kurumları tarafından desteklenmiştir.

Farelerdeki tüm prosedürler, St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzları tarafından onaylanan hayvan protokollerine göre gerçekleştirildi.
1. Çözümlerin ve ortamın hazırlanması
<ol><li>15.4 mL PBS'yi 2.5 mL 20 mg/mL kollajenaz P (5 mg/mL nihai konsantrasyon), 2 mL 11 U/mL dispas II (1.2 U/mL nihai konsantrasyon) ve 100 μL 1.0 MCaCl2 (5 mM nihai konsantrasyon) ile karıştırarak sindirim solüsyonu hazırlayın.</li>
	<li>440 mL DMEM'i 50 mL FBS (% 10), 5.0 mL kalem / strep (sırasıyla 100 U / mL ve 100 μg / mL) ve 5.0 mL glutamin takviyesi (2 mM) ile karıştırarak 500 mL primer fibroblast ortamı (DMEM tamamlandı) hazırlayın. Ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir vakum filtresi ile filtreyle sterilize edin.</li>
	<li>FBS'nin 4 ° C'de 100.000 x g'de 38.5 mL polipropilen tüplerde gece boyunca ultrasantrifüj edilmesiyle eksozom içermeyen serum hazırlayın ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>440 mL DMEM'i 50 mL eksozomsuz serum (%10), 5 mL kalem/strep (100 U/mL ve 100 μg/mL) ve 5 mL glutamin takviyesi (2 mM) ile karıştırarak 500 mL eksozomsuz ortam hazırlayın. Ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir vakum filtresi ile filtreyle sterilize edin.</li>
	<li>6.057 g Tris bazını 90 mLdH2Oiçinde çözerek ve pH'ı HCl ile 7.4'e ayarlayarak 0.5 M Tris-HCl (pH 7.4) hazırlayın.</li>
	<li>97.9 mLdH2Oile 2 mL 0.5 M Tris-HCl (pH = 7.4) ve 100 μL 1 M Mg(Ac)2 çözeltisi (sükroz çalışma çözeltisi) karıştırarak 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)/1 mM Mg(Ac)2 çözeltisi (sükroz çalışma çözeltisi) hazırlayın. Kullanmadan hemen önce çözeltiye proteaz inhibitörleri ekleyin ve çözeltiyi buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Tablo 1'e göre buz üzerinde sakaroz yoğunluk gradyan çözeltileri hazırlayın. Bu çözeltiler iki sükroz gradyan tüpü hazırlamak için yeterlidir.</li>
	<li>100 g TCA tozuna 40 mL dH2O ekleyerek %100 TCA hazırlayın ve tamamen eriyene kadar karıştırın. Son ses seviyesini dH2O ile 100 mL'ye ayarlayın.</li>
	<li>20 mL dH2O ile 80 mL %100 etanolü karıştırarak% 80 etanol hazırlayın.</li>
	<li>1.8 L dH2O ile 200 mL 10x çalışma tamponunu karıştırarak western blot çalışma tamponunu hazırlayın.</li>
	<li>1.4 L dH2O ile 200 mL 10x transfer tamponu ve 400 mL metanol karıştırarak western blot transfer tamponu hazırlayın. Transfer tamponunu 4 °C'ye önceden soğutun.</li>
	<li>122 g Tris bazı ve 180 g sodyum klorürü 850 mLdH2O(pH 8.0) içinde çözerek 20x Tris tamponlu salin (TBS) hazırlayın. Ses seviyesini dH2O ile 1 L'ye ayarlayın.</li>
	<li>5 g yağsız kuru sütü 1 mL %10 Tween-20, 5 mL 20x TBS ve 94 mL dH2O ile çözerek bloke edici tampon hazırlayın.</li>
	<li>3 g BSA'yı 1 mL %10 Tween-20, 5 mL 20x TBS ve 94 mL dH2O ile çözerek antikor tamponu hazırlayın.</li>
	<li>100 mL 20x TBS ve 20 mL %10 Tween-20 (10x) ile 1.88 LdH2O karıştırarak yıkama tamponu hazırlayın.</li>
	<li>1 hacim luminol/geliştir ile 1 hacim stabil peroksit tamponunu karıştırarak geliştirme solüsyonu hazırlayın.</li>
</ol>2. Gastroknemius (GA) fare kası diseksiyonu15,16
<ol><li>Buz üzerinde 10 mL PBS içeren 50 mL'lik tüpler hazırlayın.</li>
	<li>Fareleri bir CO2 odasında ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın.</li>
	<li>Gastroknemius kasını her iki bacaktan çıkarın ve buz üzerinde PBS ile tüpe aktarın. NOT: GA kasını PBS'ye aktarmadan önce soleus kasını GA kasından çıkarın.</li>
</ol>3. Fare primer fibroblast izolasyonu ve kültürü
<ol><li>Kasları tartın ve biyogüvenlik başlığı altında 10 cm'lik bir tabağa aktarın. İnce bir macun haline gelene kadar kasları neşterle kıyın.</li>
	<li>İnce kıyılmış kas macununu 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve tüpe 3.5x hacim/mg doku sindirim solüsyonu ekleyin ve 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. Süspansiyonu her 10 dakikada bir 5 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın (bu, tamamen ayrışmaya yardımcı olacaktır). NOT: Alternatif olarak, bu adım için bir doku ayrıştırıcı kullanılabilir.</li>
	<li>Sindirim solüsyonunu etkisiz hale getirmek için hücre süspansiyonuna 20 mL DMEM ekleyin. 50 mL'lik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 70 μm'lik bir naylon hücre süzgecine aktarın. Akışı toplayın ve hücre süzgecini ek 5 mL DMEM ile yıkayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Peletleri 10 mL DMEM complete'de yeniden süspanse edin ve hücreleri 10 cm'lik bir tabağa tohumlayın.</li>
	<li>Hücreleri 37 °C, %5 CO2, %3O2 (geçiş 0 veyaP0 ) ile kültürleyin. NOT: 1) Fizyolojik benzeri koşulları sağlamak için bu kültürlerin düşük oksijen seviyesinde tutulması gerekir (iskelet kasındaO2 seviyesi yaklaşık% 2.5'tir)17. 2) Bir hücre kültürünün geçiş numarası (örneğin, P0), kültürün kaç kez alt kültürlendiğinin bir kaydıdır. 3) P0'daki primer fibroblastlar, %100 birleşme artı 1 güne kadar (ve sadece P0 için) rutin olarak kültürlenir. Bu, diğer hücre tiplerini temizlemek ve kültürde bulunan hücrelerin, mikroskop incelemesine dayalı olarak miyojenik hücrelerden tükenmiş sadece fibroblastlar olduğundan emin olmak içindir. 2 aylıkken yetişkin bir hayvandan alınan iskelet kası yaklaşık% 2 miyojenik progenitöriçerir 4. Ek olarak, miyojenik progenitörler genellikle kaplanmamış bulaşıklara yapışmaz; bu nedenle, 18,19,20 alt kültürleme sırasında kaybolurlar. Miyojenik hücreler, %20 FBS ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF)18 ile desteklenmiş farklı bir ortam (F10) gerektirir. DMEM complete'de, orta fibroblastlar, miyojenik hücrelerden daha yüksek bir proliferasyon hızına sahiptir, bu da bu kirletici hücrelerin ilk geçişten önce ortadan kaldırılmasıyla sonuçlanır.</li>
	<li>P0 hücrelerini% 100 birleştiğinde artı 1 gün PBS ile durulayın. 1 mL tripsinizasyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 °C, %5CO2, %3O2'de inkübe edin. 10 mL DMEM complete kullanarak enzimatik aktiviteyi durdurun.</li>
	<li>Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve peleti 20 mL DMEM içinde yeniden süspanse edin ve 15 cm'lik bir tabağa tohumlayın (pasaj 1 veya P1). Hücreler %80-90 birleşene kadar büyütülür ve 3. geçişe kadar genişletilebilir. NOT: Aşağı akış deneylerine bağlı olarak geçit 1, geçit 2 (P2) veya geçit 3 (P3) kullanılabilir.</li>
</ol>4. Hücrelerin tohumlanması ve şartlandırılmış ortamın toplanması
<ol><li>Fibroblastları (P1, P2 veya P3) 10 mL PBS ile yıkayın, hücrelere 2.5 mL tripsinizasyon solüsyonu ekleyin ve 37 °C, %5 CO2, %3O2'de inkübe edin. 10 mL DMEM complete kullanarak enzimatik aktiviteyi durdurun. NOT: 4. geçişten sonra, birincil hücreler atılır ve özelliklerini değiştirdikleri için daha fazla deney için kullanılmamalıdır.</li>
	<li>Hücreleri toplayın ve 10 dakika boyunca RT'de 300 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücre peletini 10 mL eksozomsuz ortamda yeniden süspanse etti ve hücreleri saydı.</li>
	<li>Hücreleri tabak başına 1.5–2.0 x 106 hücrede (15 cm) tohumlayın ve 37 °C, %5 CO2, %3O2'de inkübe edin.</li>
	<li>Şartlandırılmış ortamı 16-24 saat arasında 50 mL'lik tüplerde buz üzerinde toplayın. NOT: Hücreler %80 birleşik değilse, taze ekzozomal serbest ortam tekrar eklenebilir ve 16-24 saatlik ek bir süre sonra toplanabilir. İki koleksiyon daha sonraki işlemler için birleştirilebilir.</li>
</ol>5. Diferansiyel ve ultra santrifüjleme kullanılarak eksozomların saflaştırılması
NOT: Tüm adımlar 4 °C'de veya buz üzerinde gerçekleştirilir. Gerektiğinde tüpü suyla dolu bir tüp ile dengeleyin.
<ol><li>Canlı hücrelerin çıkarılması için şartlandırılmış ortamı 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 50 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>Ölü hücreleri 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyerek çıkarın ve süpernatanı 38.5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.</li>
	<li>Organellerin, apoptotik cisimlerin ve membran parçalarının çıkarılması için süpernatanı 10.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 38.5 mL ultra berrak bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Eksozomları peletlemek için süpernatanı 1.5 saat boyunca 100.000 x g'da ultrasantrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı dikkatlice atın, yaklaşık 1 mL şartlandırılmış ortam bırakın ve eksozom peletini toplam 30 mL buz gibi soğuk PBS hacminde yıkayın.</li>
	<li>1,5 saat boyunca 100.000 x g'da santrifüjleyin ve ekzozomal peleti bozmamaya dikkat ederek süpernatanı pipetleyerek dikkatlice atın.</li>
	<li>Peletleri buz gibi soğuk PBS'de (15 cm'lik çanak başına ~ 25 μL) yeniden süspanse edin ve BCA protein test kiti ve 562 nm'de bir mikroplaka okuyucu kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün. NOT: Protein konsantrasyonu, dH2O'da %0.1 Triton-X100 ile 1:2seyreltme ile ölçülür. % 80 birleşmede 15 cm'lik bir tabaktan (20 mL şartlandırılmış ortam) primer fibroblastlardan eksozom verimi ~ 3-4 μg'dir.</li>
</ol>6. Eksozomların sükroz yoğunluk gradyanı ile karakterizasyonu
<ol><li>Aşağıdakileri pipetleyerek (aşağıdan yukarıya) sakaroz gradyanını 13 mL ultra berrak bir tüpe yükleyin: 1.5 mL 2.0 M, 2.5 mL 1.3 M, 2.5 mL 1.16 M, 2.0 mL 0.8 M ve 2.0 mL 0.5 M sükroz çözeltileri.</li>
	<li>30-100 μg eksozomları 0.25 M sükroz çözeltisi ile karıştırın ve hacmi 1 mL'ye ayarlayın.</li>
	<li>Eksozomları gradyanların üzerine dikkatlice yükleyin ve numuneleri 100.000 x g ve 4 °C'de 2,5 saat boyunca ultra santrifüjleyin.</li>
	<li>Tüpleri ultra santrifüjden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin ve gradyanın tepesinden başlayarak 1.0 mL'lik fraksiyonları toplayın. Bunları buz üzerinde 1.7 mL'lik tüplere aktarın.</li>
	<li>Her tüpe 110 μL %100 TCA ekleyin, iyice karıştırın ve RT'de 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>10.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice atın.</li>
	<li>Peleti 500 μL önceden soğutulmuş %80 etanol içinde yeniden süspanse edin ve numuneleri -20 °C'de 10 dakika yıkamaya bırakın.</li>
	<li>10.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Peletleri RT'de 10-15 dakika kurutun ve in vitro deneyler için peleti PBS'de yeniden süspanse edin. BCA protein test kitini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün veya peleti doğrudan 14.5 μL dH2O, 5 μL 4x Laemmli tamponu ve western blot analizleri için 0.5 μL 1 M DTT içinde yeniden süspanse edin.</li>
</ol>7. Batı leke analizi ile eksozom tespiti
<ol><li>Adım 5.7'den 5-10 μg eksozomları 5 μL 4x Laemmli tamponu ve 0.5 μL 1 M DTT ile karıştırın, ardından son hacmi dH2O ile 20 μL'ye ayarlayın. Adım 6.9'dakiler de dahil olmak üzere tüm numuneleri 98 °C'de 5 dakika ısıtın.</li>
	<li>Numuneleri %10 TGX lekesiz bir jele yükleyin ve protein merdivenlerini üreticinin tavsiyelerine göre yükleyin. NOT: İlgilenilen proteinin moleküler ağırlığına göre jelin yüzdesini seçin.</li>
	<li>Jeli, yükleme boyası jelin dibine gelene kadar ~ 1 saat boyunca çalışan tamponda 100 V'ta çalıştırın. NOT: Çalışma süresi, kullanılan ekipmana veya jelin türüne ve yüzdesine göre değişebilir.</li>
	<li>Jeli görüntüleyin. Leke tutmayan jellerin görüntüleri, immünoblotlar için yükleme kontrolü olarak kullanılır.</li>
	<li>Jeli bir PVDF membranı kullanarak 80 V'ta 1,5 saat veya gece boyunca 4 °C'de 30 V'ta aktarın.</li>
	<li>Membranları RT'de 1 saat boyunca bloke edici tamponda bloke edin.</li>
	<li>Spesifik antikorlar için membranları (Tablo 2) antikor tamponunda gece boyunca 4 ° C'de çalkalama ile inkübe edin.</li>
	<li>Membranları yıkama tamponunda yıkayın ve membranları uygun ikincil antikorlarla (Tablo 2) RT'de 1 saat çalkalama ile inkübe edin.</li>
	<li>Membranları yıkama tamponunda yıkayın ve membranları geliştirme solüsyonu ve kamera tabanlı bir görüntüleyici kullanarak görüntüleyin. Alternatif olarak, membranları geliştirmek için bir X-ışını filmi kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Extracellular+Vesicles,+Their+Origin,+Composition,+Purpose,+and+Methods+for+Exosome+Isolation+and+Analysis.">Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Isolation,+Characterization,+Biological+Function,+and+Multifarious+Therapeutic+Approaches+of+Exosomes.">Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.</a> Cells. 8 (4), 307 (2019).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+biogenesis,+biologic+function+and+clinical+potential.">Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential.</a> Cell &amp; Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).</li><li>van de Vlekkert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+exosome+release+is+the+pathogenic+pathway+linking+a+lysosomal+deficiency+to+generalized+fibrosis.">Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis.</a> Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).</li><li>Rackov, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicle-Mediated+Control+of+Cell+Function:+The+Role+of+Extracellular+Matrix+and+Microenvironment.">A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment.</a> Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases.">Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+renal+fibrosis.">The role of extracellular vesicles in renal fibrosis.</a> Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).</li><li>Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+role+of+extracellular+vesicles+and+exosomes+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis.">Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis.</a> Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).</li><li>Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+exosomes+in+liver+physiology+and+pathology.">Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology.</a> Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).</li><li>Machado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+exocytosis+mediates+cancer+progression.">Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression.</a> Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).</li><li>Tian, W., Liu, S., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+exosomes+in+cancer+metastasis.">Potential role of exosomes in cancer metastasis.</a> Biomed Research International. , 4649705 (2019).</li><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+disease.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease.</a> Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., Gonz&#225;lez-Valdez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+challenges+in+the+recovery+and+purification+of+cellular+exosomes.">Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes.</a> Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mitochondria+from+Minimal+Quantities+of+Mouse+Skeletal+Muscle+for+High+Throughput+Microplate+Respiratory+Measurements.">Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).</li><li>. Muscle Dissection in mouse Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8">https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8</a> (2016)</li><li>Mas-Bargues, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+oxygen+concentration+in+stem+cell+culture+for+regenerative+medicine.">Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).</li><li>Bois, P. R., Grosveld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKHR+(FOX01a)+is+required+for+myotube+fusion+of+primary+mouse+myoblasts.">FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts.</a> The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).</li><li>Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+muscle+progenitor+cells+have+decreased+proliferation+and+myotube+formation+during+passages.">Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages.</a> Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+tissue+engineering.">Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).</li></ol>

Yazarların hiçbirinin beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu protokolde belirtildiği gibi, eksozomların kültür ortamından başarılı bir şekilde izole edilmesi için kritik bir adım, yetişkin iskelet kasından birincil fare fibroblast kültürlerinin uygun şekilde kurulması ve sürdürülmesidir. Fizyolojik benzeri koşulları sağlamak için bu kültürlerin düşük oksijen seviyesinde tutulması gerekir (iskelet kasındakiO2 seviyesi ~%2.5'tir)15. Primer fibroblastlar kültürde çok fazla geçtiğinde özellik değiştirecektir....

Eksozomlar, boyutları 30-150 nm arasında değişen heterojen hücre dışı veziküllerdir. Doku ve organlardaher yerde dağılımları göz önüne alındığında, fizyolojik ve patolojik süreçlerde kilit oyunculardır 1,2. Eksozomlar, türetildikleri hücrelerin tipine göre değişen karmaşık bir protein, lipit, DNA tipi ve RNA tipi kargosu taşırlar 1,2,3. Eksozomlar, farklı işlevlere sahip proteinlerle zenginleştirilmiştir (yani, CD9 ve CD63 dahil tetraspaninler) füzyon olaylarından sorumludur. Örneğin, ısı şoku proteinleri HSP70 ve HSP90, antijen bağlanması ve sunumunda rol oynar. Ek olarak, Alix, Tsg101 ve flotilin, eksozom biyogenezi ve salınımına katılır ve bu nanoveziküllerin 2,3,4 belirteçleri olarak yaygın olarak kullanılır.
Eksozomlar ayrıca, aşağı akış sinyalinietkiledikleri alıcı hücrelere aktarılabilen çeşitli RNA'lar (yani mikroRNA'lar, uzun kodlamayan RNA'lar, ribozomal RNA'lar) içerir 3. Tek bir birim zarla çevrili olan eksozom biyoaktivitesi, yalnızca proteinlerin ve nükleik asitlerin kargosuna değil, aynı zamanda sınırlayıcı zarın1 lipit bileşenlerine de bağlıdır. Ekzozomal membranlar, fosfatidilserin, fosfatidik asit, kolesterol, sfingomyelin, araşidonik asit ve diğer yağ asitleri açısından zenginleştirilmiştir ve bunların tümü eksozom stabilitesini ve membran topolojisinietkileyebilir 2,3. Kargo ve lipid düzenlemesinin bir sonucu olarak, eksozomlar alıcı hücrelerde sinyal yollarını başlatır ve normal doku fizyolojisininkorunmasına katılır 1,2,4,5. Belirli patolojik koşullar altında (ör., nörodejenerasyon, fibroz ve kanser), patolojik uyaranları tetikledikleri ve yaydıkları gösterilmiştir 4,6,7,8,9,10,11.
Sinyalleri komşu veya uzak bölgelere yayma yetenekleri nedeniyle, eksozomlar, hastalık durumlarının teşhisi veya prognozu için değerli biyobelirteçler haline gelmiştir. Ek olarak, eksozomlar deneysel olarak terapötik bileşiklerin araçları olarak kullanılmıştır 2,12. Bu nanoveziküllerin klinikte potansiyel uygulaması, maksimum verim, saflık ve tekrarlanabilirlik elde etmek için izolasyon yöntemini giderek daha önemli hale getirmektedir. Eksozomların izolasyonu için farklı teknikler geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Genel olarak, eksozomlar, diferansiyel santrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi ve bağışıklık yakalama (ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak) ile şartlandırılmış hücre kültürü ortamından veya vücut sıvılarından izole edilebilir. Her yaklaşımın daha önce tartışılan benzersiz avantajları ve dezavantajları vardır 1,2,13,14.
Ana hatlarıyla belirtilen protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonu ve kültürüne ve 2) bu hücreler tarafından kültür ortamına salınan eksozomların saflaştırılmasına ve karakterizasyonuna odaklanmaktadır. Fonksiyonel çalışmalar için eksozomların primer fibroblastlardan izolasyonu için iyi kurulmuş bir protokol şu anda eksiktir. Primer fibroblastlar büyük miktarlarda eksozom salgılamaz, bu da izolasyon ve saflaştırma sürecini zorlaştırır. Bu protokol, morfolojik bütünlüklerini ve fonksiyonel aktivitelerini korurken büyük kültür hacimlerinden büyük miktarlarda saf eksozomların saflaştırılmasını açıklar. Şartlandırılmış ortamdan elde edilen saflaştırılmış eksozomlar, alıcı hücrelerde spesifik sinyal yollarını indüklemek için in vitro alım deneylerinde başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, birden fazla biyolojik örnekten alınan ekzozomal kargoların karşılaştırmalı proteomik analizleri için de kullanılmıştır4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific, TPP</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620659/5427754008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>11 213 857 001</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Millipore/Sigma, Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion Blotter with plate electrodes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX stain-free protein gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5678034</td>
			<td>10% 18-well, midi-gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion vertical electrophoresis cell (midi)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>NC0165100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>04 942 078 001</td>
			<td>neutral protease, grade II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma/Millipore, Roche</td>
			<td>10708984001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification Eagles Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluostar Omega multi-mode microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63052-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>LabScientific</td>
			<td>M-0842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2/CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MC0-18M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td>
			<td>AVSC1510</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected disposable scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer (70 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher brand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal west Femto</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>16110734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge Optima XPM</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tube (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tubes (25x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Isotemp 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts

Eksozomlar, hemen hemen tüm hücreler tarafından salınan ve tüm biyolojik sıvılarda salgılanan küçük hücre dışı veziküllerdir. Bu veziküllerin izolasyonu için ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisi dahil olmak üzere birçok yöntem geliştirilmiştir. Bununla birlikte, hepsi büyük ölçekli eksozom saflaştırması ve karakterizasyonu için uygun değildir. Burada özetlenen, yetişkin fare iskelet kaslarından izole edilen primer fibroblast kültürlerinin oluşturulması için bir protokoldür, ardından bu hücrelerin kültür ortamından eksozomların saflaştırılması ve karakterizasyonu yapılır. Yöntem, sıralı santrifüjleme adımlarının ve ardından sakaroz yoğunluk gradyanlarının kullanımına dayanmaktadır. Ekzozomal preparatların saflığı daha sonra bir dizi kanonik belirteç (yani, Alix, CD9 ve CD81) kullanılarak western blot analizleri ile doğrulanır. Protokol, elektron mikroskobu, kütle spektrometrisi ve fonksiyonel çalışmalar için alım deneyleri için biyoaktif eksozomların nasıl izole edileceğini ve konsantre edileceğini açıklar. Kolayca büyütülebilir veya küçültülebilir ve farklı hücre tiplerinden, dokulardan ve biyolojik sıvılardan eksozom izolasyonu için uyarlanabilir.

Bu protokol, eksozomların büyük hacimlerde şartlandırılmış ortamdan uygun maliyetli bir şekilde saflaştırılması için uygundur. Prosedür son derece tekrarlanabilir ve tutarlıdır. Şekil 1 , fare primer fibroblastlarının kültür ortamından saflaştırılan eksozomların transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüsünü göstermektedir. Şekil 2 , kanonik ekzozomal belirteçlerin protein ekspresyon modelini ve sitozolik (LDH) ve ER (kalnek...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

isolation-characterization-exosomes-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

3.2K Görüntüleme.  St. Jude Children's Research Hospital. Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.

Video: Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biyoloji

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...