Alessandra d'Azzo ist Inhaberin des Stiftungslehrstuhls für Genetik und Gentherapie von Jewelers for Children (JFC). Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH-Zuschüsse R01GM104981, RO1DK095169 und CA021764, die Assisi Foundation of Memphis und die American Lebanese Syrian Associated Charities unterstützt.

Alle Eingriffe an Mäusen wurden nach Tierprotokollen durchgeführt, die vom St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee und den Richtlinien der National Institutes of Health genehmigt wurden.
1. Vorbereitung von Lösungen und Medien
<ol><li>Bereiten Sie die Aufschlusslösung vor, indem Sie 15,4 ml PBS mit 2,5 ml 20 mg/ml Kollagenase P (5 mg/ml Endkonzentration), 2 ml 11 U/ml Dispase II (1,2 U/ml Endkonzentration) und 100 μl 1,0 M CaCl2 (5 mM Endkonzentration) mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 ml primäres Fibroblastenmedium (DMEM komplett) vor, indem Sie 440 ml DMEM mit 50 ml FBS (10 %), 5,0 ml Pen/Streptokokken (100 U/ml bzw. 100 μg/ml) und 5,0 ml Glutaminpräparat (2 mM) mischen. Filtersterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22 μm Porengrößen-Vakuumfilter.</li>
	<li>Exosomenfreies Serum durch nächtliche Ultrazentrifugation von FBS in 38,5-ml-Polypropylenröhrchen bei 100.000 x g bei 4 °C herstellen und den Überstand in ein neues Röhrchen überführen.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 ml exosomenfreies Medium vor, indem Sie 440 ml DMEM mit 50 ml exosomenfreiem Serum (10 %), 5 ml Pen/Streptokokken (100 U/ml und 100 μg/ml) und 5 ml Glutaminpräparat (2 mM) mischen. Filtersterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22 μm Porengrößen-Vakuumfilter.</li>
	<li>Bereiten Sie 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) vor, indem Sie 6,057 g Trisbase in 90 mldH2Oauflösen und den pH-Wert mit HCl auf 7,4 einstellen. Stellen Sie das Volumen mit dH2O auf 100 ml ein.</li>
	<li>Bereiten Sie 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM Mg(Ac)2-Lösung (Saccharose-Arbeitslösung) vor, indem Sie 97,9 mldH2Omit 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,4) und 100 μl 1 M Mg(Ac)2 mischen. Geben Sie kurz vor Gebrauch Protease-Inhibitoren in die Lösung und lassen Sie die Lösung auf Eis.</li>
	<li>Saccharose-Dichtegradientenlösungen auf Eis gemäß Tabelle 1 herstellen. Diese Lösungen reichen aus, um zwei Saccharose-Gradientenröhrchen herzustellen.</li>
	<li>Bereiten Sie 100% TCA vor, indem Sie 40 ml dH2O zu 100 g TCA-Pulver geben und mischen, bis es sich vollständig aufgelöst hat. Stellen Sie die Endlautstärke mit dH2O bis 100 ml ein.</li>
	<li>Bereiten Sie 80 % Ethanol vor, indem Sie 20 mldH2Omit 80 ml 100%igem Ethanol mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie den Western-Blot-Laufpuffer vor, indem Sie 1,8 ldH2O mit 200 ml 10-fachem Laufpuffer mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie den Western-Blot-Transferpuffer vor, indem Sie 1,4 ldH2Omit 200 ml 10-fachem Transferpuffer und 400 ml Methanol mischen. Transferpuffer auf 4 °C vorkühlen.</li>
	<li>Bereiten Sie 20x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) vor, indem Sie 122 g Trisbase und 180 g Natriumchlorid in 850 mldH2O(pH 8,0) auflösen. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 L mit dH2O ein.</li>
	<li>Bereiten Sie den Blockierungspuffer vor, indem Sie 5 g fettfreie Trockenmilch mit 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS und 94 mldH2Oauflösen.</li>
	<li>Bereiten Sie den Antikörperpuffer vor, indem Sie 3 g BSA mit 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS und 94 mldH2Oauflösen.</li>
	<li>Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie 100 ml 20x TBS und 20 ml 10% Tween-20 (10x) mit 1,88 l dH2O mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Entwicklungslösung vor, indem Sie 1 Volumen Luminol/Enhance mit 1 Volumen stabilen Peroxidpuffers mischen.</li>
</ol>2. Dissektion des Musculus gastrocnemius (GA) der Maus15,16
<ol><li>Bereiten Sie 50-ml-Röhrchen mit 10 ml PBS auf Eis vor.</li>
	<li>Euthanasie der Mäuse in einer CO2 - Kammer, gefolgt von einer Zervixluxation.</li>
	<li>Entfernen Sie den Gastrocnemius-Muskel von beiden Beinen und übertragen Sie ihn in den Schlauch mit PBS auf Eis. HINWEIS: Entfernen Sie den Musculus soleus aus dem GA-Muskel, bevor Sie den GA-Muskel auf PBS übertragen.</li>
</ol>3. Isolierung und Kultur der primären Fibroblasten der Maus
<ol><li>Wiegen Sie die Muskeln und geben Sie sie in eine 10-cm-Schale unter einer Biosicherheitshaube. Die Muskeln mit Skalpellen zerkleinern, bis eine feine Paste entsteht.</li>
	<li>Die fein gehackte Muskelpaste in ein 50-ml-Röhrchen überführen und 3,5x Volumen/mg Gewebe der Aufschlusslösung in das Röhrchen geben und 45 Minuten bei 37 °C inkubieren. Mischen Sie die Suspension alle 10 Minuten gründlich mit einer 5-ml-Pipette (dies hilft bei der vollständigen Dissoziation). HINWEIS: Alternativ kann für diesen Schritt ein Gewebedissoziator verwendet werden.</li>
	<li>Geben Sie 20 ml DMEM complete in die Zellsuspension, um die Aufschlusslösung zu inaktivieren. In ein 70-μm-Nylonzellsieb geben, das auf ein 50-ml-Röhrchen gelegt wird. Fangen Sie den Durchfluss auf und waschen Sie das Zellsieb mit zusätzlichen 5 ml DMEM complete.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird bei 300 x g bei Raumtemperatur (RT) für 10 min zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml DMEM complete und säen Sie die Zellen in eine 10-cm-Schale.</li>
	<li>Die Zellen werden bei 37 °C, 5 % CO2, 3 %O2 (Durchgang 0 oder P0) kultiviert. HINWEIS: 1) Diese Kulturen müssen auf einem niedrigen Sauerstoffgehalt gehalten werden, um physiologisch ähnliche Bedingungen zu gewährleisten (O2-Spiegel in der Skelettmuskulatur beträgt etwa 2,5 %)17. 2) Die Durchgangsnummer (z. B. P0) einer Zellkultur ist eine Aufzeichnung der Häufigkeit, mit der die Kultur subkultiviert wurde. 3) Primäre Fibroblasten bei P0 werden routinemäßig bis zu 100% Konfluenz plus 1 Tag (und nur für P0) kultiviert. Dies dient dazu, andere Zelltypen zu reinigen und sicherzustellen, dass die in der Kultur vorhandenen Zellen nur Fibroblasten sind, die auf der Grundlage der mikroskopischen Untersuchung von myogenen Zellen befreit sind. Der Skelettmuskel eines erwachsenen Tieres im Alter von 2 Monaten enthält etwa 2 % myogene Vorläuferzellen4. Darüber hinaus heften sich myogene Vorläuferzellen in der Regel nicht an die unbeschichteten Schalen; Daher gehen sie bei der Subkultivierung verloren18,19,20. Myogene Zellen benötigen ein anderes Medium (F10), das mit 20 % FBS und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) ergänzt wird18. Bei DMEM complete haben mittlere Fibroblasten eine höhere Proliferationsrate als die myogenen Zellen, was dazu führt, dass diese kontaminierenden Zellen vor der ersten Passage eliminiert werden.</li>
	<li>Spülen Sie die P0-Zellen mit PBS, wenn sie zu 100 % flüssig sind, plus 1 Tag. 1 ml Trypsinisierungslösung zugeben und bei 37 °C, 5 % CO2, 3 %O2 inkubieren, um die Zellen abzulösen. Stoppen Sie die enzymatische Aktivität, indem Sie 10 ml DMEM complete verwenden.</li>
	<li>Die Zellen werden bei 300 x g für 10 min bei RT zentrifugiert und das Pellet in 20 ml DMEM complete resuspendiert und in eine 15-cm-Schale (Passage 1 oder P1) gesät. Die Zellen werden bis zu einer Konfluenz von 80 % bis 90 % gezüchtet und können bis zur Passage 3 expandiert werden. HINWEIS: Abhängig von den nachgeschalteten Experimenten kann Passage 1, Passage 2 (P2) oder Passage 3 (P3) verwendet werden.</li>
</ol>4. Aussaat der Zellen und Entnahme des konditionierten Mediums
<ol><li>Waschen Sie die Fibroblasten (P1, P2 oder P3) mit 10 ml PBS, geben Sie 2,5 ml Trypsinisierungslösung zu den Zellen und inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO2, 3 %O2. Stoppen Sie die enzymatische Aktivität, indem Sie 10 ml DMEM complete verwenden. HINWEIS: Nach Passage 4 werden die Primärzellen verworfen und sollten nicht für weitere Experimente verwendet werden, da sie ihre Eigenschaften verändern.</li>
	<li>Die Zellen werden gesammelt und bei 300 x g bei RT für 10 Minuten zentrifugiert.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml exosomenfreiem Medium und zählen Sie die Zellen.</li>
	<li>Die Zellen werden bei 1,5–2,0 x 106 Zellen pro Schale (15 cm) ausgesät und bei 37 °C, 5 % CO 2, 3 %O2 inkubiert.</li>
	<li>Sammeln Sie das konditionierte Medium zwischen 16 und 24 Stunden in 50-ml-Röhrchen auf Eis. HINWEIS: Wenn die Zellen nicht zu 80 % konfluent sind, kann nach einem zusätzlichen Zeitraum von 16 bis 24 Stunden wieder frisches exosomalfreies Medium hinzugefügt und gesammelt werden. Die beiden Kollektionen können zur Weiterverarbeitung kombiniert werden.</li>
</ol>5. Aufreinigung von Exosomen mittels Differential- und Ultrazentrifugation
HINWEIS: Alle Schritte werden bei 4 °C oder auf Eis durchgeführt. Gleichen Sie den Schlauch bei Bedarf mit einem mit Wasser gefüllten Schlauch aus.
<ol><li>Zentrifugieren Sie das konditionierte Medium bei 300 x g für 10 Minuten zur Entfernung lebender Zellen und überführen Sie den Überstand in ein neues 50-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Entfernen Sie abgestorbene Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 10 Minuten und überführen Sie den Überstand in ein 38,5-ml-Polypropylenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 x g für 30 Minuten, um Organellen, apoptotische Körper und Membranfragmente zu entfernen. Den Überstand in ein ultraklares 38,5-ml-Röhrchen überführen.</li>
	<li>Ultrazentrifugieren Sie den Überstand 1,5 h lang bei 100.000 x g , um die Exosomen zu pelletieren.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, lassen Sie etwa 1 ml konditioniertes Medium übrig und waschen Sie das Exosomenpellet in einem Gesamtvolumen von 30 ml eiskaltem PBS.</li>
	<li>Bei 100.000 x g für 1,5 h zentrifugieren und den Überstand vorsichtig durch Pipettieren entsorgen, wobei darauf zu achten ist, dass das exosomale Pellet nicht gestört wird.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in eiskaltem PBS (~25 μl pro 15-cm-Schale) und messen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Protein-Assay-Kit und einem Mikroplatten-Reader bei 562 nm. HINWEIS: Die Proteinkonzentration wird durch eine 1:2-Verdünnung mit 0,1% Triton-X100 indH2Ogemessen. Die Ausbeute an Exosomen aus einer 15-cm-Schale (20 ml konditioniertes Medium) von primären Fibroblasten bei 80%iger Konfluenz beträgt ~3–4 μg.</li>
</ol>6. Charakterisierung von Exosomen durch Saccharosedichtegradient
<ol><li>Laden Sie den Saccharosegradienten in ein ultraklares 13-ml-Röhrchen, indem Sie (von unten nach oben) Folgendes pipettieren: 1,5 ml 2,0 m, 2,5 ml 1,3 m, 2,5 ml 1,16 m, 2,0 ml 0,8 m und 2,0 ml 0,5 M Saccharoselösungen.</li>
	<li>Mischen Sie 30–100 μg Exosomen mit 0,25 M Saccharoselösung und stellen Sie das Volumen auf 1 ml ein.</li>
	<li>Laden Sie die Exosomen vorsichtig auf die Gradienten und zentrifugieren Sie die Proben 2,5 h lang bei 100.000 x g und 4 °C.</li>
	<li>Nehmen Sie die Röhrchen aus der Ultrazentrifuge und legen Sie sie auf Eis und sammeln Sie 1,0 ml Fraktionen beginnend am oberen Ende des Gradienten. Füllen Sie sie in 1,7-ml-Röhrchen auf Eis.</li>
	<li>Geben Sie 110 μl 100% TCA in jedes Röhrchen, mischen Sie es gut und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.</li>
	<li>10 min bei 10.000 x g und RT zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen.</li>
	<li>Das Pellet wird in 500 μl vorgekühltem 80%igem Ethanol resuspendiert und die Proben 10 Minuten lang bei -20 °C gewaschen.</li>
	<li>10 min bei 10.000 x g und 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Trocknen Sie das Pellet für 10–15 Minuten bei RT und resuspendieren Sie das Pellet in PBS für In-vitro-Experimente. Messen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Protein-Assay-Kit oder resuspendieren Sie das Pellet direkt in 14,5 μldH2O, 5 μl 4x Laemmli-Puffer und 0,5 μl 1 M DTT für Western-Blot-Analysen.</li>
</ol>7. Detektion von Exosomen durch Western-Blot-Analyse
<ol><li>Mischen Sie 5–10 μg Exosomen aus Schritt 5.7 mit 5 μl 4x Laemmli-Puffer und 0,5 μl 1 M DTT und stellen Sie dann das Endvolumen mit dH2O auf 20 μl ein. Erhitzen Sie alle Proben, einschließlich der Proben in Schritt 6.9, 5 Minuten lang bei 98 °C.</li>
	<li>Laden Sie die Proben in ein 10% TGX fleckenfreies Gel und laden Sie die Proteinleitern gemäß den Empfehlungen des Herstellers. HINWEIS: Wählen Sie den Prozentsatz des Gels entsprechend dem Molekulargewicht des interessierenden Proteins.</li>
	<li>Lassen Sie das Gel bei 100 V ~1 h im Laufpuffer laufen, bis sich der Ladefarbstoff am Boden des Gels befindet. HINWEIS: Die Laufzeit kann je nach verwendetem Gerät oder Art und Prozentsatz des Gels variieren.</li>
	<li>Stellen Sie sich das Gel vor. Bilder der farbfreien Gele werden als Beladungskontrolle für Immunoblots verwendet.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gel mit einer PVDF-Membran für 1,5 h bei 80 V oder über Nacht bei 30 V bei 4 °C.</li>
	<li>Blockieren Sie die Membranen im Blockierungspuffer für 1 h bei RT.</li>
	<li>Die Membranen für spezifische Antikörper (Tabelle 2) werden in Antikörperpuffer über Nacht bei 4 °C unter Rühren inkubiert.</li>
	<li>Waschen Sie die Membranen in Waschpuffer und inkubieren Sie die Membranen mit den entsprechenden Sekundärantikörpern (Tabelle 2) für 1 h bei RT unter Rühren.</li>
	<li>Waschen Sie die Membranen in einem Waschpuffer und bilden Sie die Membranen mit einer Entwicklungslösung und einem kamerabasierten Imager ab. Alternativ können Sie auch einen Röntgenfilm verwenden, um die Membranen zu entwickeln.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Extracellular+Vesicles,+Their+Origin,+Composition,+Purpose,+and+Methods+for+Exosome+Isolation+and+Analysis.">Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Isolation,+Characterization,+Biological+Function,+and+Multifarious+Therapeutic+Approaches+of+Exosomes.">Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.</a> Cells. 8 (4), 307 (2019).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. 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Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu deklarieren.

Ein entscheidender Schritt für die erfolgreiche Isolierung von Exosomen aus den Nährmedien, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist die ordnungsgemäße Etablierung und Aufrechterhaltung von primären Maus-Fibroblastenkulturen aus adulter Skelettmuskulatur. Diese Kulturen müssen auf einem niedrigen Sauerstoffgehalt gehalten werden, um physiologisch ähnliche Bedingungen zu gewährleisten (O2-Spiegel in der Skelettmuskulatur beträgt ~2,5 %)15. Primäre Fibroblasten ändern ihre Eige...

Exosomen sind heterogene extrazelluläre Vesikel mit einer Größe von 30 bis 150 nm. Sie sind aufgrund ihrer ubiquitären Verteilung in Geweben und Organen etablierte Schlüsselakteure in physiologischen und pathologischen Prozessen 1,2. Exosomen tragen eine komplexe Fracht von Proteinen, Lipiden, DNA-Typen und RNA-Typen, die je nach Art der Zellen, von denen sie stammen, variieren 1,2,3. Exosomen sind mit Proteinen angereichert, die unterschiedliche Funktionen haben (z. B. Tetraspanine, einschließlich CD9 und CD63), die für Fusionsereignisse verantwortlich sind. Zum Beispiel sind die Hitzeschockproteine HSP70 und HSP90 an der Antigenbindung und -präsentation beteiligt. Darüber hinaus sind Alix, Tsg101 und Flotillin an der Biogenese und Freisetzung von Exosomen beteiligt und werden häufig als Marker dieser Nanovesikel verwendet 2,3,4.
Exosomen enthalten auch eine Vielzahl von RNAs (d. h. microRNAs, lange nicht-kodierende RNAs, ribosomale RNAs), die auf Empfängerzellen übertragen werden können, wo sie die nachgeschaltete Signalübertragung beeinflussen3. Da die Bioaktivität des Exosoms von einer einzigen Membran umschlossen ist, hängt sie nicht nur von der Ladung von Proteinen und Nukleinsäuren ab, sondern auch von den Lipidkomponenten der begrenzenden Membran1. Exosomale Membranen sind mit Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Cholesterin, Sphingomyelin, Arachidonsäure und anderen Fettsäuren angereichert, die alle die Stabilität des Exosoms und die Membrantopologie beeinflussen können 2,3. Als Ergebnis der Ladungs- und Lipidanordnung initiieren Exosomen Signalwege in aufnehmenden Zellen und sind an der Aufrechterhaltung der normalen Gewebephysiologie beteiligt 1,2,4,5. Unter bestimmten pathologischen Bedingungen (z. B. Neurodegeneration, Fibrose und Krebs) hat sich gezeigt, dass sie pathologische Reize auslösen und verbreiten 4,6,7,8,9,10,11.
Aufgrund ihrer Fähigkeit, Signale an benachbarte oder entfernte Orte weiterzugeben, sind Exosomen zu wertvollen Biomarkern für die Diagnose oder Prognose von Krankheiten geworden. Darüber hinaus wurden Exosomen experimentell als Vehikel therapeutischer Verbindungenverwendet 2,12. Durch die potenzielle Anwendung dieser Nanovesikel in der Klinik wird die Isolierungsmethode immer wichtiger, um maximale Ausbeute, Reinheit und Reproduzierbarkeit zu erreichen. Verschiedene Techniken zur Isolierung von Exosomen wurden entwickelt und implementiert. Im Allgemeinen können Exosomen aus konditionierten Zellkulturmedien oder Körperflüssigkeiten durch Differentialzentrifugation, Größenausschlusschromatographie und Immuneinfang (unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits) isoliert werden. Jeder Ansatz hat einzigartige Vor- und Nachteile, die bereits erörtert wurden 1,2,13,14.
Das skizzierte Protokoll konzentriert sich auf die 1) Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Gastrocnemius-Muskel der Maus und 2) die Reinigung und Charakterisierung von Exosomen, die von diesen Zellen in das Kulturmedium freigesetzt werden. Ein gut etabliertes Protokoll für die Isolierung von Exosomen aus primären Fibroblasten für funktionelle Studien fehlt derzeit. Primäre Fibroblasten sezernieren keine großen Mengen an Exosomen, was den Isolierungs- und Reinigungsprozess zu einer Herausforderung macht. Dieses Protokoll beschreibt die Aufreinigung großer Mengen reiner Exosomen aus großen Kulturvolumina unter Beibehaltung ihrer morphologischen Integrität und funktionellen Aktivität. Gereinigte Exosomen, die aus konditioniertem Medium gewonnen wurden, wurden erfolgreich in In-vitro-Aufnahmeexperimenten eingesetzt, um spezifische Signalwege in Empfängerzellen zu induzieren. Sie wurden auch für vergleichende proteomische Analysen von exosomalen Ladungen aus mehreren biologischen Proben verwendet4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific, TPP</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620659/5427754008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>11 213 857 001</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Millipore/Sigma, Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion Blotter with plate electrodes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX stain-free protein gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5678034</td>
			<td>10% 18-well, midi-gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion vertical electrophoresis cell (midi)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>NC0165100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>04 942 078 001</td>
			<td>neutral protease, grade II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma/Millipore, Roche</td>
			<td>10708984001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification Eagles Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluostar Omega multi-mode microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63052-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>LabScientific</td>
			<td>M-0842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2/CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MC0-18M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td>
			<td>AVSC1510</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected disposable scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer (70 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher brand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal west Femto</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>16110734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge Optima XPM</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tube (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tubes (25x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Isotemp 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts

Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel, die von praktisch allen Zellen freigesetzt und in allen biologischen Flüssigkeiten sezerniert werden. Für die Isolierung dieser Vesikel wurden viele Methoden entwickelt, darunter Ultrazentrifugation, Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie. Allerdings eignen sich nicht alle für die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen in großem Maßstab. Hier wird ein Protokoll für die Etablierung von Kulturen primärer Fibroblasten beschrieben, die aus adulten Skelettmuskeln von Mäusen isoliert wurden, gefolgt von der Reinigung und Charakterisierung von Exosomen aus den Kulturmedien dieser Zellen. Die Methode basiert auf der Verwendung von sequentiellen Zentrifugationsschritten, gefolgt von Saccharosedichtegradienten. Die Reinheit der exosomalen Präparate wird dann durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung einer Reihe von kanonischen Markern (d. h. Alix, CD9 und CD81) validiert. Das Protokoll beschreibt, wie bioaktive Exosomen für Elektronenmikroskopie, Massenspektrometrie und Aufnahmeexperimente für funktionelle Studien isoliert und konzentriert werden. Es kann leicht nach oben oder unten skaliert und für die Exosomenisolierung aus verschiedenen Zelltypen, Geweben und biologischen Flüssigkeiten angepasst werden.

Dieses Protokoll eignet sich für die kostengünstige Aufreinigung von Exosomen aus großen Mengen konditionierten Mediums. Das Verfahren ist hochgradig reproduzierbar und konsistent. Abbildung 1 zeigt ein Transmissionselektronenmikroskopie-Bild (TEM) von Exosomen, die aus dem Kulturmedium von primären Fibroblasten der Maus gereinigt wurden. Abbildung 2 zeigt das Proteinexpressionsmuster kanonischer exosomaler Marker und die Abwesenheit von zytosolischen (LDH) ...

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Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

isolation-characterization-exosomes-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

3.2K Aufrufe.  St. Jude Children's Research Hospital. Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.

Serie: Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Forschung

Biologie

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...