Ce protocole nous permet d’isoler les populations de fibroblastes activées par quiescent et induite par des blessures avec une pureté significative. Le principal avantage de cette technique est sa flexibilité pour l’improvisation. Pour le flux, ainsi que l’isolement à base de perles, on peut incorporer des anticorps contre les cellules contaminantes pour les exclure des cellules cibles isolées.
Cette technique est principalement utilisée pour l’isolement fibroblaste cardiaque. Cependant, il peut être utilisé pour isoler les fibroblastes d’autres tissus. Meiling Melzer, stagiaire de premier cycle, et David Beier, assistant de recherche de mon laboratoire, démontreront cette procédure.
Pour préparer une assiette de six puits pour stocker six cœurs pendant la dissection, distribuez deux millilitres de KHB froid dans chaque puits et placez la plaque sur la glace. Vaporiser le corps avec 70% d’éthanol. Orientez-le pour que le côté ventral soit face à l’expérimentateur.
Épinglez les appendices pour éviter les interférences. Sans percer le foie, coupez la peau abdominale et le muscle. Couper verticalement vers le sternum, en ouvrant soigneusement le thorax sans percer le cœur.
Ensuite, continuer à couper à travers la cage thoracique pour exposer le cœur. À l’aide de forceps, soulevez doucement le cœur de la poitrine, coupant tout poumon ou tissu excédentaire attaché à l’extérieur du cœur. Séparez le ventricule gauche.
Pour chaque dissection, placez le ventricule dans un puits séparé de la plaque de six puits. Tout d’abord, utilisez des forceps pour presser et agiter à plusieurs reprises le ventricule dans KHB pour éliminer l’excès de sang. Transférer le ventricule dans une assiette propre, stérile et carrée de 10 centimètres carrés.
Ensuite, à l’aide d’une lame à bord unique, hacher rapidement le ventricule en petits morceaux. Ajouter un millilitre de cocktail de digestion collagène, et continuer à hacher. Lorsque les morceaux sont assez petits pour être transférés avec une micropipette d’un millilitre, transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres.
Laver l’assiette deux fois avec deux millilitres de cocktail et transférer le lavage dans le tube. Incuber le tube pendant 30 minutes, et résusquer les cellules comme décrit dans le manuscrit à l’aide d’une pipette de cinq millilitres. Après la résuspension initiale, incuber les cellules pendant 15 minutes, et résuspendre à nouveau à l’aide d’une pipette de 10 millilitres.
Ensuite, placez une passoire cellulaire de 40 micromètres sur un nouveau tube conique de 50 millilitres et amorcez la passoire en la mouillant d’un à deux millilitres de KHB. Ajouter 25 millilitres de KHB à la suspension de digestion, et resuspendre. Filtrer la suspension à travers la passoire, en remplaçant la passoire au besoin.
Centrifuger le filtrate à 400 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez le supernatant et réutilisez la pastille dans un tampon de lyse RBC 1x à l’aide de cinq millilitres de tampon par cœur. Après avoir incubé la suspension pendant deux minutes à température ambiante, centrifuger la suspension à 400 fois g pendant 10 minutes à température ambiante.
Retirez le supernatant, puis resuspendez la pastille en un millilitre de KHB. Ensuite, ajoutez neuf millilitres de KHB à la suspension. Filtrer la suspension à travers une passoire cellulaire amorcée de 40 micromètres dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.
Centrifuger le tube conique à 400 fois g pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, retirez le supernatant et resuspendez la pastille dans un millilitre de médias fibroblastes ou PBS. Une fois que le numéro de cellule a été déterminé, les fibroblastes peuvent être isolés de la suspension par trois méthodes différentes décrites dans le manuscrit.
Pour commencer l’isolement par placage différentiel, préparez une plaque de six puits en ajoutant deux millilitres de médias fibroblastes à chaque puits. Faites tourbillonner la plaque pour couvrir le fond du puits. Si les cellules cardiaques de la souris sont suspendues dans PBS, centrifugeuses et les résuspendent en un millilitre de médias fibroblastes par cœur.
Ajouter un millilitre de suspension cellulaire, l’équivalent d’un cœur, à chaque puits. Faites tourbillonner la plaque pour répartir uniformément les cellules. Ajoutez un à deux millilitres supplémentaires de médias fibroblastes par puits pour un volume total de jusqu’à quatre millilitres par puits.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Parce que les fibroblastes adhèrent sélectivement aux puits, ils peuvent être isolés en enlevant et en jetant les médias. Lavez les cellules attachées restantes avec deux millilitres de PBS, puis ajoutez deux à quatre millilitres de médias fibroblastes stériles par puits.
Incuber à 37 degrés jusqu’au confluent, en changeant les médias tous les deux à quatre jours. Pour commencer l’étiquetage magnétique et la séparation des cellules hématopoïétiques CD45-positives, centrifugez une suspension des cellules cardiaques de souris à 500 fois g pendant cinq minutes. Retirez le supernatant et résépendez la pastille cellulaire en un millilitre de tampon d’équilibrage.
Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Après avoir centrifugé les cellules à nouveau, résuspendez la pastille cellulaire dans le tampon d’équilibrage. Ajouter les perles magnétiques CD45 positives et bien mélanger.
Incuber pendant au moins 15 minutes à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules en ajoutant un tampon d’équilibrage et une centrifugeuse à 500 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnatant et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
Resuspendez la pastille dans un tampon d’équilibrage. Passez la suspension à travers un filtre de 40 micromètres pour empêcher les agrégations cellulaires d’obstruer la colonne de séparation. Ensuite, placez une colonne de séparation dans le champ magnétique d’un séparateur approprié et équilibrez la colonne avec au moins trois millilitres de PBS.
Versez la suspension cellulaire à travers la colonne, et de recueillir le flux à travers, qui contiendra les cellules non étiquetées, dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon d’équilibrage et combinez les lavages avec le passage. Retirez la colonne du séparateur et placez la colonne sur un tube conique de 15 millilitres.
Pour élucider les cellules CD45-positives étiquetées, pipette cinq millilitres de tampon d’équilibrage dans la colonne, et plonger la colonne fermement. Centrifugez le tube d’élitente et le tube de flow-through à 500 fois g. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
Pour compléter l’isolement, suivez les protocoles dans le manuscrit pour les cellules endothéliales CD31-positives et les fibroblastes MEFSK4-positifs, qui sont similaires au protocole pour les cellules CD45-positives. Le tri cellulaire activé par fluorescence a été effectué sur des cellules individuelles isolées des cœurs de souris alpha-SMA-GFP suivant l’infarctus du myocarde. Un système de gating représentatif démontre que les cellules positives au GFP co-expriment le CD31, le CD45 ou l’AN2.
Dans les coeurs blessés de souris, un petit pourcentage des cellules endothéliales et des cellules hématopoïétiques ont exprimé GFP. Cependant, les cellules gfp-positives/CD31-négatives/CD45-négatives n’ont pas exprimé AN2, un marqueur de péricyte. Les cellules GFP-positives ont exprimé alpha-SMA, collagène un alpha, periostine, et vimentin.
Les fibroblastes non blessés isolés par adhérence sélective ont exprimé vimentin mais n’ont pas démontré l’expression de l’alpha-SMA, de la periostine, ou du collagène un alpha. Les fibroblastes non blessés et activés ont exprimé l’antigène MEFSK4. Les fibroblastes non blessés, isolés par adhérence sélective, et les myofibroblastes, isolés et triés à partir de souris alpha-SMA-GFP, ont démontré une capacité à contracter le collagène.
Il est important de bien hacher le tissu avant l’incubation. Avant la séparation à base de perles, il est important de passer la suspension à travers un filtre de 40 micromètres pour empêcher les agrégations cellulaires. Les cellules purifiées par cette méthode pourraient être purifiées à l’aide de perles magnétiques associées à des anticorps spécifiques au péricyte pour assurer un niveau élevé de pureté.
Avec la disponibilité de nouveaux anticorps conjugués aux perles, ainsi que de souris transgéniques reporter, on peut utiliser ces techniques pour isoler et étudier des populations cellulaires distinctes, pas seulement les fibroblastes.
