La Société Max Planck et une allocation Junior Groupe Göttingen Graduate School à HB a financé ce travail.

1. Instruments, Culture Media, et Plats <ol><li> Utilisation d&#39;un microscope qui est capable de maintenir l&#39;échantillon au point et qui est équipé d&#39;une étape automatique. Construire un couvercle chauffe-mesure ou acheter une solution commerciale. Mettre en place un EMCCD LED-système de caméra dans lequel l&#39;exposition de la caméra déclenche l&#39;éclairage LED à travers un signal TTL en utilisant les instructions du fabricant. Remarque: Voir la discussion pour plus de détails. </li><li> Polydimethylsiloxane (PDMS) timbres: <ol><li> Fabriquer PDMS timbres dans un centre de la microfluidique ou PDMS ont les timbres produits par une fonderie commerciale. Pour utiliser une fonderie commerciale, envoyer un fichier autocad à la société et spécifier la profondeur (15 um, par exemple) de l&#39;appareil. Après la livraison de la fonderie, couper la puce PDMS dans ses 16 timbres au moyen d&#39;un scalpel. </li><li> Lier chaque timbre individu à une lame de verre en utilisant du plasma de l&#39;air. Pour le collage, exposer à la fois le timbre de PDMS et la lame de verre à plasma d&#39;air pour uncombat 1 min (en utilisant les paramètres les plus élevés de plasma à 0,5 mbar). Veiller à ce que les surfaces de collage sont confrontés à la hausse au cours du traitement par plasma. Ensuite, placez le timbre PDMS sur la lame de verre. </li></ol></li><li> Prenez un plat en bas de 3,5 cm et découpez un carré de 18 x 18 mm à partir du centre du fond du plat à l&#39;aide d&#39;une fraiseuse verticale et couteaux rotatifs tranchants. Utiliser une faible vitesse de rotation du dispositif de coupe et d&#39;alimentation lente pour empêcher la matière plastique de la fonte en raison de la chaleur produite par le frottement. Préparer plusieurs plats à la fois. Remarque: Le fond plat peut être réutilisé plusieurs fois après l&#39;expérience si elle est nettoyée après trempage dans de l&#39;éthanol pur O / N. </li><li> Agarose: <ol><li> Dissoudre 3 g de point de fusion élevé agarose dans 100 ml S-basale (5,85 g NaCl, 1 g de K 2 HPO 4, 6 g de KH 2 PO 4, 1 ml cholestérol (5 mg / ml dans de l&#39;éthanol), H 2 O à 1 L, stériliser à l&#39;autoclave) par ébullition. Assurez aliquotes du agarose dissout dans 2 ml tubes Eppendorf et store. En outre, de préparer un lot de bas point de fusion agarose exactement de la même manière que le point de fusion élevé agarose. </li><li> Avant utilisation, placer 3 aliquotes de point de fusion élevé agarose sur un bloc de chauffage à 95-98 ° C. Avant utilisation, placer une aliquote de bas point de fusion agarose sur un bloc de chauffage à 95-98 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit fondu, puis sur un bloc de chauffage à 30 - 35 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Sélection des animaux <ol><li> Cultivez les vers à une faible densité sur des plaques NGM ensemencées pour obtenir des animaux propres. Assurez-vous que il ya beaucoup de nourriture et seuls quelques animaux sur la plaque. </li><li> Pour l&#39;imagerie larves L1, transférer environ 30 oeufs contenant des embryons au stade de bretzel sur une nouvelle plaque ensemencée NGM. Pour transférer les stades larvaires plus tard ou adultes C. elegans, transférer environ 30 vers sur une nouvelle plaque ensemencée NGM. </li></ol> 3. Préparation de Agarose microchambres <ol><li> Préparation du plat: <ol><li>Prenez un plat en plastique avec une ouverture carrée de 18 x 18 mm à la base et placez-le à l&#39;envers avec l&#39;ouverture vers le haut. Fermez l&#39;ouverture en plaçant un morceau de ruban adhésif double-face collante de 20 x 20 mm sur l&#39;ouverture. Mettez le plat autour de sorte que le ruban adhésif est sur le fond et placer le plat sur une surface dure. Couper l&#39;ouverture libre à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> Avec une pipette P1000, remplissez 2 ml de 3% point de fusion élevé agarose dans S-Basal dans le plat. Placez le agarose sur la zone qui entoure l&#39;ouverture et laisser solidifier. Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est solide. </li><li> Tourner autour du plat et de décoller le film de protection qui recouvre l&#39;adhésif double-face collante de sorte que le côté collant restera sur le plat et sera exposée. Remarque: Par conséquent, un anneau amende de ruban adhésif va entourer l&#39;extérieur de l&#39;ouverture. L&#39;agarose sert de réservoir d&#39;humidité qui seront ensuite entourer l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> Fonderie de microchambres: <ol><li> Exposer ee surface de PDMS pour le moulage avec un plasma d&#39;air pour 20 à 60 sec. Remarque: Ce traitement par plasma rend les PDMS surface hydrophile, ce qui empêche le piégeage de bulles d&#39;air et produit des impressions nettes. </li><li> Construire deux entretoises de hauteur égale par l&#39;empilement de 5-9 des lames de verre. Place, en parallèle à leurs côtés longs, la première entretoise pile, puis une lame de verre unique, puis de nouveau une entretoise pile. Passer la lame de verre qui contient le tampon PDMS orthogonalement à travers les pièces d&#39;écartement. Ajuster la hauteur des entretoises de sorte qu&#39;il existe un espace d&#39;environ 1,5 mm entre la surface de moulage du poinçon PDMS et la lame de verre unique. </li><li> Déposer une goutte de liquide chaud-point de fusion élevé agarose sur la lame de verre unique près du timbre en PDMS et rapidement glisser les PDMS timbre verticalement dans l&#39;agarose liquide. Laissez le agarose solidifier. Vérifiez que cela devient un aspect opaque, qui prend habituellement environ 2 min. Retirez le timbre verticalement avec un mouvement. Remarque: Il est commode à GLue l&#39;entretoise glisse avec du ruban double-face collante. Le mouvement vertical du tampon empêche les bulles d&#39;air de se trouver piégé dans l&#39;agarose. </li></ol></li><li> Transférer les œufs ou les vers avec des bactéries OP50 sur le agarose en utilisant une amende choix de fil de platine. Distribuez un oeuf ou un ver par chambre avec de la nourriture à l&#39;aide d&#39;un cil. Remplissez environ 30 oeufs sur un plot agarose. </li><li> Couper la dalle agarose contenant les microchambres remplis dans un carré d&#39;environ 15 x 15 mm afin qu&#39;il tienne bien dans l&#39;ouverture de la coupelle. Ramassez la dalle agarose carré avec une pince et placez-le à l&#39;envers sur une lamelle de verre de 20 x 20 mm. Une fois tombé, ne pas soulever à nouveau ou faites-le glisser autour parce que cela peut causer des bactéries et des vers de terre pour être poussés hors de leurs chambres. </li><li> Assemblée de l&#39;antenne: <ol><li> Placer la lamelle de verre sur l&#39;ouverture de la coupelle en plastique. Appuyez doucement la lamelle de verre sur la bague faite de ruban adhésif double-face collante.Prenez soin de ne pas briser le verre. </li><li> Mettez le plat à l&#39;envers et utiliser une pipette P1000 pour combler l&#39;écart entre la dalle agar contenant les microchambres et le réservoir de liquide agarose à bas point de fusion agarose refroidi à environ 30 ° C. Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est solidifié. </li><li> Sceller le plat avec un couvercle. Pour microscopes inversés utiliser un couvercle chauffant. Pour les microscopes droits utiliser un couvercle normal et sceller le plat avec du Parafilm. </li></ol></li><li> Après avoir terminé la préparation de microchambres, vérifiez-les sous un stéréomicroscope. L&#39;exactitude de remplissage est crucial. Voir la discussion pour plus de détails. </li></ol> 4. Imagerie de calcium <ol><li> Utilisez souches transgéniques exprimant capteurs de calcium génétiquement codés tels que HBR16 (goeIs5 [rmnp-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3&#39;UTR, unc-119 (+)]) 27. </li><li> Utilisez un microscope composé équipée pour grand champ épifluorescence. Connectez la sortie TTL de la caméra EMCCD àl&#39;entrée TTL de la LED, de sorte que chaque fois que la caméra enregistre une image de l&#39;échantillon est éclairé. Utilisez un temps d&#39;exposition d&#39;environ 5 ms. Utilisez le gain EM dans la gamme de 50 - 300. </li><li> Spécifiez un film d&#39;éclatement fonctionnement pendant 24 heures à chaque ver imagé tous les 15 - 30 min abord pendant 20 secondes avec DIC, puis pendant 20 secondes avec une fluorescence de la GFP pour enregistrer GCaMP, et ensuite prendre une image finale du signal mKate2 est pris pour le contrôle des niveaux d&#39;expression. Utilisez un taux de 2 / sec de cadre lors de chaque salve. </li><li> Pour l&#39;inspection visuelle de données, utilisez une carte en fausses couleurs pour améliorer la visibilité de petites variations de l&#39;intensité de fluorescence. Terrain données fluorescentes que AF / F, avec F étant la valeur de base moyenne de fluorescence. Une description détaillée de l&#39;analyse des données de calcium peuvent être trouvées dans la littérature 20. </li></ol> 5. parallèle AMI de Worms multiples <ol><li> Placer le plat contenant les microchambres sur le microscope, se concentrer sur l&#39;échantillon et engager le autofocus. Mettre en place un protocole de logiciel de sorte que la caméra prend une rafale de 40 trames d&#39;image en 20 sec chaque demi-heure pendant 24 heures, ce qui se traduira par 1.920 images par vis sans fin, une quantité raisonnable de données. Mettre en place la numérisation de sorte qu&#39;il visite chaque ver utilisant la scène. Viser à filmer environ 30 vers en un seul passage. </li><li> Image de multiples vers de zoom arrière, soit en utilisant un faible grossissement. Utilisez un faible grossissement pour couvrir plusieurs microchambres avec la puce de la caméra et de filmer plusieurs microchambres adjacentes simultanément. Après la fin de l&#39;acquisition d&#39;image, séparer les données pour chaque chambre individuelle par découpe d&#39;une région d&#39;intérêt portant sur un animal. </li><li> Pour évaluer rapidement les données de mobilité, utiliser de soustraction 28-32. </li></ol> 6. imagerie différentes étapes de la vie de C. elegans <ol><li> Utilisez microchambres agarose pour toutes les étapes de la vie de C. elegans de L1 à l&#39;âge adulte et dont dauers. Utilisez les dimensions de la chambre appropriées pour différentes étapes de la vie qui apparaissent dans le tableau 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> l&#39;étape de vie </td><td> taille de la Chambre </td><td> Profondeur de champ </td><td> Durée d&#39;enregistrement typique </td><td> Grossissement </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 um </td><td> 10 - 15 um </td><td> oeuf - mi L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 um </td><td> 15 pm </td><td> oeuf - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer larve </td><td> 370 x 370 um </td><td> 25 um </td><td> 4 jours </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td><td> L4 jeune - jeune adulte </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Jeune adulte </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td&gt; <td> 12 - 24 h </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Tableau 1. tailles Chambre pour les différentes étapes de la vie. Montré sont dimensions de la chambre et de grossissements qui sont utiles pour diverses étapes optimisés pour une puce de caméra 8 x 8 mm.

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M., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+behavioral+quiescence+in+Caenorhabditis+elegans.">Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. , (2014).</li><li>Nagy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+Caenorhabditis+elegans+larvae+reveals+a+novel+locomotion+switch,+regulated+by+Galphas+signaling.">A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling.</a> eLife. 2, e00782 (2013).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. 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P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Matériel L&#39;objectif d&#39;un microscope sera généralement la dérive lors de l&#39;acquisition d&#39;image à long terme. Pour microscopes composés, se concentrer maintien systèmes peuvent être achetés auprès des principaux fabricants de microscopes. Dans le cas d&#39;un microscope composé avec commande de mise au point est trop cher, une alternative simple serait d&#39;utiliser une loupe binoculaire. Microscopes composés permettent l&#39;utilisation d&#39;objectifs avec une ouverture numérique élevée (NA) et peuvent être facilement automatisés. Objectifs de pétrole 40X sont bien adaptés. lentilles d&#39;immersion de l&#39;eau ne sont pas idéal en raison de l&#39;évaporation lors de l&#39;imagerie à long terme. Contraste interférentiel différentiel (DIC) génère un joli contraste qui permet de suivre les changements morphologiques et comportementales, mais simple, l&#39;imagerie du champ lumineux peut également être utilisé. Pour DIC ou l&#39;imagerie en champ clair, utiliser la lumière rouge en plaçant un filtre de lumière rouge dans le chemin dia-éclairage du microscope. Pour la numérisation de plusieurs microchambres une étape automatisée est nécessaire. Meilleure performance est achieved quand une étape est utilisé qui a accélération et de décélération non linéaire et peut être programmé à basse vitesse de balayage pour éviter de perturber les animaux lors de la numérisation. Nous avons pas observé les réactions comportementales ou augmentation de calcium dans les neurones mécanosensibles (ALM et PLM) pendant le balayage, ce qui suggère en effet que la numérisation lente ne pas activer le système mécanosensible du ver (données non présentées). Systèmes à DEL commerciaux peuvent être utilisés. Plusieurs compagnies offrent des solutions prêtes à l&#39;emploi qui incluent les diodes à différentes longueurs d&#39;onde. La LED devrait avoir la possibilité de déclencher l&#39;extérieur de la LED avec un signal TTL. Une caméra très sensible est nécessaire pour l&#39;imagerie de calcium des animaux en mouvement. caméras EMCCD sont les caméras les plus sensibles sur le marché. La caméra doit avoir une sortie TTL lors de l&#39;exposition (aussi appelé de sortie &quot;de feu&quot;). Dispositif de chauffage du couvercle est nécessaire pour éviter la condensation sur le couvercle si l&#39;on utilise un microscope inversé. Sur un microscope droit, le plat sera placé de telle sorte que le couvercle wiserai en bas et ainsi on empêche la condensation et pas de chauffage du couvercle est nécessaire. Le couvercle doit fermer hermétiquement le plat pour éviter l&#39;évaporation de l&#39;eau lors de l&#39;imagerie à long terme. PDMS timbres La surface du tampon de PDMS contenant la structure pour le moulage de l&#39;agarose est confronté à une distance de la lame de verre, qui supporte le timbre PDMS. Une liste des entreprises qui offrent des puces microfluidiques personnalisé peut être trouvée sur Wikipedia ( <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Combler les nématodes dans leurs chambres Ceci est l&#39;étape la plus critique dans le protocole et les points suivants doivent être pris en considération: A) La moiteur de l&#39;agarose est crucial pour transférer les vers et pour l&#39;imagerie. Si l&#39;agarose est trop humide, à savoir, il est un liquide coveRing une superficie de plusieurs microchambres, il ne sera pas possible de distribuer de la nourriture et les vers bactérienne d&#39;une manière contrôlée parce que le liquide rendra les bactéries écoulent. Si l&#39;agarose est trop sec puis les bactéries et les vers ne peuvent pas descendre le pick facilement, ce qui signifie que plus de force doit être utilisée pour déposer les vers et les bactéries qui provoque facilement des dommages à l&#39;agarose. Lors du remplissage dans un grand nombre de vers l&#39;agarose peut tarir. Dans le pire des cas, l&#39;agarose sera tellement sec à la fin ce que les chambres seront effondrer. Si l&#39;agarose est trop sec, il peut être réhydraté en plaçant une petite goutte (environ 2 pi) de S-basale sur le côté de la puce où il n&#39;y a pas de vers. Puis tremper le fil de platine ramasser dans le liquide et même tirer une partie du liquide dans la zone où les chambres sont remplies avec des vers. B) La quantité de nourriture est essentiel pour le succès de l&#39;imagerie à long terme. Si il n&#39;y a pas assez de nourriture, les vers peuvent courir hors de lui. En cas de nourriture excessive de la cavité de la chambrene sera pas se comporter comme un liquide, mais plutôt comme un solide et permettra des vers d&#39;échapper à la chambre en poussant les bactéries. Viser à obtenir une suspension bactérienne qui remplit toute la chambre. Les vers sont en contact physique constant avec la surface de la gélose et le verre le long de la plupart de leur longueur pendant l&#39;expérience et le comportement ramper semble similaire au mouvement sur une plaque et différente de rosser en liquide. C) mécanique dommageable de l&#39;agarose peut ruiner l&#39;expérience. Une amende choix est essentiel. Il ne doit pas avoir des coins pointus. Un cils douce attaché à une pointe de pipette peut être utilisé pour déplacer des bactéries ou des vers dans les chambres au lieu d&#39;utiliser un pick de platine. Dans la plupart des cas, cependant, l&#39;agarose surséchée est la raison de dommages. Le pic ou cils devraient, idéalement, à peine toucher le agarose lui-même, et le film d&#39;eau sur la surface d&#39;agarose devrait retirer les vers et les bactéries. Quand les chambres d&#39;étanchéité, de plus, l&#39;humidité de l&#39;agarose est essentielle. Il ne devrait pasêtre tout liquide libre sur la surface de la gélose parce que cela peut laver les bactéries et les vers pendant le scellement. Grosses bulles peuvent être enlevés en soulevant doucement un coin de la dalle agar. De petites bulles plus petites que la chambre souvent piégés à l&#39;intérieur des chambres. Ces bulles ne sont pas un problème et vont disparaître par absorption. Après le montage de l&#39;antenne, vérifier à nouveau que l&#39;agarose est pas trop sec ou trop humide. Les chambres doivent être bien fermés et il ne devrait pas y avoir de flux de liquide entre les chambres. Si l&#39;agarose est trop humide, les chambres ne sont pas étanches. Worms peuvent échapper ou leur nourriture seront emportés. Si l&#39;échantillon est trop humide, simple d&#39;ouvrir le couvercle et laisser sécher agarose pendant une minute ou deux. Si l&#39;agarose est trop sec, les chambres peuvent effondrer et les vers vont échapper. Mise à l&#39;échelle par un zoom arrière Pour l&#39;imagerie de fluorescence, un zoom arrière est limitée par la faible quantité de lumière obtenue à faible grossissement. En outre, EMCCD caméras sont optimisé pour une sensibilité et ont souvent une résolution relativement faible. Toutefois, la mise à l&#39;imagerie quatre fois est bien possible. Par exemple, quatre chambres de 190 um x 190 um peuvent tenir sur une image lors de l&#39;utilisation 140X grossissement (réalisé en utilisant un 20X Objectif et une caméra 0.7X montage) et un pixel de 512 x 512, 8 x 8 mm caméra. Une caméra haute résolution avec une grande puce (comme sCMOS caméras, 16,6 mm x puce de 14 mm, 2560 x 2560 pixels = 5.5 mégapixels) optimise l&#39;intensification des DIC et l&#39;imagerie en champ clair. Par exemple, jusqu&#39;à 30 vers L1 à 190 um x 190 um chambres peuvent tenir sur chaque image de cette caméra en utilisant un grossissement 100x (voir Figure 3). En principe, un zoom arrière et la numérisation peut également être combinés pour obtenir encore plus de numéros d&#39;animaux. La plupart des neurones restent tout à fait bien au point, de sorte qu&#39;un seul plan focal doit être imagée. Si les neurones se trouvent à sortir de la mise au point, az numérisation à l&#39;aide d&#39;un lecteur de piézo peut être prise à chaque fois point. Adaptation aux différents comportements Ce protocole donne une bonne idée du comportement à travers des échelles de temps longues. Il est évident que la synchronisation des salves doit être adaptée à différents comportements et stades de la vie. Limites de la technique Plusieurs facteurs limitent la durée de l&#39;imagerie. Le plus important est la quantité de nourriture. Une fois que la nourriture est consommée, les larves cessé de se développer. Ainsi, dans de petites chambres (190 x 190 um) vers se développent jusqu&#39;au stade L3, puis arrêter. Si une durée de temps de formation d&#39;image est nécessaire, de plus grandes chambres doivent être utilisés. La durée maximale de l&#39;imagerie à long terme est de l&#39;ordre de 2,5 à 3 jours. Si plus imagerie est nécessaire, les vers doivent être récupérés et placés dans de nouvelles chambres. Lorsque imagerie vers adultes, une autre limitation est causée par la progéniture de ces vers. Les vers adultes pondent des œufs à partir de laquelle les larves éclosent. Ces larves sera également rester à l&#39;intérieur de la chambre, Consommer de la nourriture, et peuvent perturber l&#39;analyse d&#39;image. Si la progéniture est un problème, une solution est d&#39;utiliser soit les adultes stériles ou de placer plusieurs reprises les vers dans les chambres fraîches. Pour récupérer les vers, la dalle agarose contenant la chambre est coupée gratuit avec un scalpel, on arrache la lamelle, et est placé sur une plaque NGM à partir de laquelle les vers peuvent être récupérés. Une autre limite est la restriction des vers à des zones relativement petites. Cela peut être un problème si le mouvement à long terme doit être analysé. Alors que les animaux dans les chambres peuvent être stimulées mécaniquement et optogenetically 21,27,34,35, la nature fermée de la chambre, il sera difficile d&#39;appliquer stimulants solubles ou volatiles. Gaz biologiquement importants tels que l&#39;oxygène ou le dioxyde de carbone peuvent se diffuser librement dans la gélose. Le grand réservoir d&#39;air dans le plat devrait maintenir les concentrations de gaz dans les chambres constants sur le temps nécessaire pour les expériences. Cependant, il faut garder à l&#39;esprit que la Concentratio locale d&#39;oxygènen dans la chambre peut ressembler de plus les conditions trouvées dans une culture liquide de la culture sur la plaque. Importance par rapport aux méthodes existantes Les dispositifs microfluidiques ont grandement avancé comportement et du développement étudié en C. elegans. Souvent, les structures microfluidiques sont faites de PDMS 12. Ici, nous décrivons un protocole pour générer des chambres de culture microfluidiques fabriqués à partir d&#39;agarose. La force de cette technique est la combinaison de haute qualité d&#39;imagerie, la corrélation du comportement avec des mesures physiologiques, imagerie à long terme, et un assez haut débit. Haute qualité d&#39;image est obtenue par l&#39;imagerie à travers la lamelle de verre en utilisant des objectifs à grande ouverture numérique. Par conséquent, l&#39;imagerie par fluorescence tel que l&#39;imagerie de calcium et l&#39;imagerie confocale de structures sous-cellulaires peut être effectuée. Parce que les animaux ne sont pas immobilisés comme dans d&#39;autres systèmes, il permet une corrélation avec le comportement des mesures physiologiques. Because les animaux ont suffisamment de nourriture, ils continuent à développer l&#39;imagerie permettant à long terme. Ce système peut l&#39;image de beaucoup de vers en une seule opération parce que les animaux sont limités à leurs chambres définies. Ainsi, ce procédé peut être facilement mis à l&#39;échelle en place 9,27,34-36. Les applications futures Jusqu&#39;à présent, ce système a été utilisé principalement pour étudier le comportement de sommeil en C. elegans larves L1. Cependant, l&#39;adaptation à toutes les étapes, il sera possible d&#39;étudier un large éventail de comportements aussi dans dauers et les adultes. Un large éventail de comportements peut être étudiée avec cette technique allant de l&#39;accouplement à la ponte.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>high-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP(E)164-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Vision Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compound microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>now sold as iXon Ultra 897</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-23G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lid heater</td>
			<td>MPI workshop</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Nano Scan Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x-y-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Proscan III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stamp</td>
			<td>Abbott Laboratories&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red light filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET660/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td colspan="2">Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided sticky tape</td>
			<td>Sellotape/Henkel</td>
			<td>double sided 12mm x 33 m</td>
			<td>alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

Le comportement est contrôlé par le système nerveux. Imagerie calcique est une méthode simple chez le nématode Caenorhabditis elegans transparent pour mesurer l&#39;activité des neurones au cours de divers comportements. Pour corréler l&#39;activité neuronale avec le comportement, l&#39;animal ne doit pas être immobilisé, mais devrait être en mesure de se déplacer. Beaucoup de changements de comportement se produisent pendant de longues échelles de temps et nécessitent l&#39;enregistrement au cours de nombreuses heures de comportement. Cela rend également nécessaire à la culture des vers à la présence de nourriture. Comment les vers peuvent être cultivées et leur activité neuronale imagée sur des échelles de temps longues? Agarose Microchambre Imaging (AMI) a déjà été développé à la culture et observer les petites larves et a été adapté pour étudier toutes les étapes de la vie du début L1 jusqu&#39;au stade adulte de C. elegans. AMI peut être effectuée sur divers stades de vie de C. elegans. Imagerie calcique à long terme est obtenue sans immobiliser les animaux en utilisant des expositions à court extérieur déclenchées comcombinée avec une multiplication d&#39;électrons de dispositif d&#39;enregistrement (EMCCD) caméra à couplage de charge. Zoom arrière ou la numérisation peut évoluer jusqu&#39;à cette méthode à l&#39;image jusqu&#39;à 40 vers en parallèle. Ainsi, un procédé est décrit pour le comportement de l&#39;image et l&#39;activité neuronale sur des échelles de temps longues dans toutes les étapes de la vie de C. elegans.

Microchambres agarose peuvent être appliquées à toute étape de la vie de C. elegans. Comme on peut le voir sur la figure 1A, le développement des larves et le comportement au cours du sommeil L1 lethargus peuvent être observées. Affichés sont des tailles de chambre qui sont 190 x 190 um, 10 um de profondeur. Si des échelles de temps plus longues sont nécessaires, les grandes chambres peuvent être utilisés. Comme on peut le voir sur la figure 1B, en utilisant une chambre avec des dimensions plus grandes (370 x 370 um, 25 um de profondeur) permet le développement de C. elegans de l&#39;oeuf jusqu&#39;à l&#39;adulte. Figure 1C montre une analyse des changements à long terme dans le comportement en utilisant le principe de soustraction d&#39;un ver grandi dans une chambre de l&#39;oeuf jusqu&#39;à l&#39;adulte. Montré sont des intensités moyennes après soustraction d&#39;une image pour rafales sélectionnés pendant sillage et lethargus. La baisse de l&#39;intensité moyenne après les valeurs cadre de soustraction est élevé, plus la mobilité du ver. Montré sont choisis traces d&#39;éclatement d&#39;un état d&#39;éveil et une condition de lethargus par stade larvaire. Leaugmentation observée en intensité moyenne au cours du développement est principalement due à l&#39;augmentation de contraste et la taille de l&#39;animal. Figure 1D montre une larve dauer, un stade de remplacement de la vie qui est engagée dans des conditions environnementales défavorables 33. taille de la chambre est de 370 x 370 um, 15 um de profondeur. Notez que la larve de dauer a été placée dans la chambre sans nourriture bactérienne, ce qui provoquerait la sortie du stade larvaire dauer. Figure 1E montre un ver adulte qui a déjà mis beaucoup d&#39;oeufs dans la chambre. Dimensions de la chambre utilisée pour l&#39;adulte étaient 700 x 700 um, 45 um de profondeur. Enfin, la figure 1F montre un hermaphrodite adulte et un accouplement mâle à l&#39;intérieur d&#39;une chambre d&#39;adulte. Imagerie calcique dans les vers mobiles est possible avec des capteurs de calcium GCaMP. Figures 2A, B montrent imagerie calcique de la commande interneurone AVA pour une larve L1 27. Les figures 2C, D montrent une activité de calcium pour la SAme type de neurone dans un animal adulte. Mettre en place l&#39;imagerie à long terme est possible par la numérisation et en zoomant sur. Figure 3A montre la qualité d&#39;image de l&#39;imagerie simultanée de 30 vers sur une puce de la caméra avec un appareil photo de 5 mégapixels. La figure 3B montre la qualité de 4 vers calcium imagée simultanément d&#39;image. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> Figure 1. Adaptation de l&#39;AMI à tous les stades de la vie de C. elegans. (A) Larve imagée à partir de début L1 jusqu&#39;à ce stade précoce L2 en 190 x 190 um chambres. (B) le développement de l&#39;oeuf jusqu&#39;à l&#39;adulte dans une chambre 370 x 370 um. (C) La mobilité d&#39;un ver évaluée à l&#39;aide de soustraction. Montré est l&#39;intensité moyenne de toutes les images de l&#39;image après soustraction d&#39;une image pour un film en rafale sélectionnée pour chaque sta larvairege sillage et le comportement lethargus. (D) Une larve de dauer en l&#39;absence d&#39;alimentation dans une chambre de 370 x 370 um. Hermaphrodite (E) des adultes avec de nombreux œufs pondus dans une chambre de 700 x 700 um. (F) d&#39;accouplement d&#39;un mâle et d&#39;une hermaphrodite intérieur d&#39;une chambre de 700 x 700 pm. YA signifie jeune adulte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> Figure 2. imagerie de calcium avec AMI. (A) d&#39;imagerie de calcium avec GCaMP3 dans la commande interneurone AVA des larves L1 en utilisant le promoteur RMN-1. Montré sont deux images en fausses couleurs. Dans l&#39;image de gauche, l&#39;activité de AVA est faible et le ver ne fait pas un mouvement vers l&#39;arrière. Dans l&#39;image de droite l&#39;activité de AVA est<html> haute, et le ver se déplace vers l&#39;arrière. transitoires (B) de calcium dans le temps pour un ver L1. (C, D) transitoires de calcium dans un animal adulte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Figure 3. imagerie multiples vers en parallèle par un zoom arrière. (A) de l&#39;imagerie simultanée de 30 L1 vers par trame utilisant 190 x 190 um chambres et un grossissement 100X (en utilisant un objectif 10X) et une puce de caméra 16,6 x 14 mm. (B) de l&#39;imagerie simultanée de quatre vers L3 par image à l&#39;aide de 370 x 370 um chambres et 100X et une région d&#39;intérêt d&#39;une puce de caméra 16,6 x 14 mm.et = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambres agarose à long terme de l&#39;imagerie calcique<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.5K vues.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

Vidéo: Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans à l&#39;apprentissage butanone, à court terme et à long terme Tests mémoire associative

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

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Neurosciences

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

À long terme de suivi comportemental de librement piscine faiblement poisson électrique

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

UNE<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensemble d&#39;aversion en cuivre à base d&#39;état nutritionnel

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Génération et entretien à long terme sans nerve<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Microchambres agarose à long terme de l'imagerie calcique

Résumé

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C. elegans à l'apprentissage butanone, à court terme et à long terme Tests mémoire associative

Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

Un indicateur moléculaire de l'adaptation à long terme olfactive dans

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

A

À long terme de suivi comportemental de librement piscine faiblement poisson électrique

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

UNE

Génération et entretien à long terme sans nerve

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans