Nous présentons pour la première fois une nouvelle approche pour la génération reproductible et évolutive, des cellules IPS dérivées aux organoïdes cerebellar, et une condition chimique définie, utilisant des bioréacteurs à usage unique. Pour obtenir des cellules pour l’ensemencement du bioré réacteur, ajouter un millilitre de milieu de détachement cellulaire, à chaque puits d’une plaque de six puits d’iPSC humain. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant sept minutes, jusqu’à ce que de douces secousses détachent facilement les cellules du puits.
À l’aide d’une micropipette P 1000, pipet le milieu de détachement cellulaire, de haut en bas, jusqu’à ce que les cellules se dissocient en cellules simples. Ensuite, ajouter deux millilitres, de milieu de culture cellulaire complète à chaque puits, cela inactive la digestion enzymatique. Ensuite, utilisez la pipette, pour transférer doucement les cellules dans un tube conique stérile.
Centrifuger le tube à 210 fois la gravité pendant trois minutes. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans le milieu de culture. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et essayez le colorant bleu.
Voyez le vaisseau bioréacteur avec l’iPSC, à une densité de 250 000 cellules par millilitre. Insérez le récipient bioréacteur, dans l’unité de base universelle, dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 95% d’humidité et 5% de dioxyde de carbone. Pour favoriser l’agrégation iPSC, réglez le taux d’agitation de l’unité de contrôle de base à 27 RPM.
Le premier jour, le jour zéro étant le jour de l’ensemencement du bioréacteur, placez le bioréacteur et l’unité de base dans un capot d’écoulement stérile, puis utilisez une pipette sérologique, pour recueillir un échantillon d’un millilitre, de la suspension cellulaire. Plaquez la suspension cellulaire dans un attachement ultra faible, 24 plaque de puits. Utilisez un microscope pour confirmer que des agrégats dérivés de l’iPSC se sont formés.
Si c’est le cas, capturer des images des agrégats à 40 X ou 100 X.Continuer à faire la culture de l’iPSC et le bioréacteur, jusqu’à ce que le diamètre moyen des agrégats, est de 100 micromètres, puis remplacer 80% du milieu, par MT01 frais sans inhibiteur de la roche. Lorsque les agrégats atteignent 200 à 250 micromètres de diamètre, laissez tous les organoïdes s’installer, au fond du bioréacteur, puis remplacer tout le milieu usé, par un milieu de différenciation gfCDM. Placez l’unité de base et le bioréacteur dans l’incubateur et diminuez l’agitation à 25 RPM.
Après avoir enlevé le supernatant des organoïdes stockés, ajouter un millilitre de 15% saccharose à la pastille, et bien mélanger en tourbillonnant doucement. Après avoir incubé les organoïdes pendant la nuit, à quatre degrés Celsius, retirer la solution de saccharose, puis ajouter un millilitre de saccharose de 15%, 7,5% de gélatine, et mélanger rapidement en tourbillonnant doucement. Alors que les organoïdes couvent à 37 degrés Celsius remplir un récipient en plastique à mi-chemin avec le saccharose 15%7,5% solution gélatine, et lui permettre de se solidifier.
Après l’incubation des organoïdes depuis une heure, utilisez une pipette Pasteur, pour placer une goutte du mélange organoïde de gélatine saccharose, sur le saccharose solidifié et la gélatine. Après avoir attendu 15 minutes pour que la goutte se solidifie, remplissez le reste du contenant en plastique, avec plus de 15% de saccharose, 7,5% de gélatine, laissez-le se solidifier complètement à température ambiante, puis l’incuber pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Couper la gélatine en cube, avec les organoïdes au centre, fixer le cube à un morceau de carton, avec une goutte de composé OCT, puis placé 250 millilitres d’Isopentane, dans une tasse de 500 millilitres, remplir un récipient approprié, avec de l’azote liquide.
À l’aide de forceps et de gants épais, placer soigneusement la tasse d’Isopentane, à la surface de l’azote liquide. L’isopentane et les azotes liquides sont des réédités dangereux. L’utilisation de ces deux reagents nécessite un équipement de protection individuelle, y compris des gants épais et une ventilation adéquate.
Lorsque l’Isopentane, refroidi à 80 degrés Celsius négatif, placer le cube de gélatine dans l’Isopentane jusqu’à ce qu’il gèle. Un cube bien congelé, produit un son métallique lorsqu’il est légèrement tapé avec des forceps, indiquant qu’il est prêt à être stocké. Laver les diapositives au microscope contenant les sections organoïdes, avec 50 millilitres 1X PBS pendant cinq minutes, puis transférer les diapositives dans un bocal Coplin, contenant 1X PBS frais.
Transférer les diapositives dans un bocal Coplin, contenant 50 millilitres de glycine fraîchement préparée et incuber pendant 10 minutes à température ambiante, puis transférer les glissières dans un bocal Coplin, contenant 50 millilitres de 0,1%Triton, et perméabilisé pendant 10 minutes à température ambiante. Lavez les diapositives deux fois avec 1X PBS, pendant cinq minutes à chaque fois. Préparer le plat immunostaining, avec du papier de trois millimètres, trempé dans 1X PBS.
Séchez les glissières avec un tissu tout autour des tranches et placez-les sur le papier de trois millimètres. À l’abri d’une pipette Pasteur, couvrir chaque glissière de 0,5 millilitres de solution de blocage. Après avoir couver pendant 30 minutes à température ambiante, enlever l’excès de solution de blocage et conduire les glissières avec un tissu, tout autour des tranches.
Placez 50 microlitres d’anticorps primaires dilués sur chaque glissière et couvrez-les de glissements de couvercle. Lacez les diapositives, dans le plat immunostaining précédemment préparé, et incubez-les à quatre degrés Celsius. Après l’incubation pendant la nuit, transférer les glissières dans un bocal Coplin, avec 50 millilitres de TBST, laisser tomber le couvercle, puis laver les glissières trois fois avec tbst, pendant cinq minutes à chaque fois.
Placer 50 microlitres, d’anticorps secondaires dilués sur chaque glissière, et couvrir avec les feuillets de couverture. Placer les diapositives, dans le plat immunostaining préalablement préparé, incuber pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Transférez les diapositives dans un bocal Coplin à nouveau, et lavez-les trois fois avec 50 millilitres de TBST, pendant cinq minutes à chaque fois.
À l’aide d’une pipette Pasteur, à 0,5 millilitres de solution dappy, sur toute la surface de chaque toboggan et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après 24 heures dans le bioréacteur, les agrégats en forme de sphéroïde formés efficacement par l’iPSC. La morphologie a été bien maintenue jusqu’au cinquième jour, avec une augmentation graduelle de la taille.
Démontrer un haut degré d’homogénéité. Une analyse quantitative par microscopie, a également indiqué la distribution normale, des tailles d’agrégat par jour un, et les deux lignes cellulaires ont atteint la taille optimale d’agrégat par jour deux. Après que le diamètre global désiré ait été réalisé, l’engagement neuronal a été induit, et puis la génération, de différents progéniteurs cerebellar a été favorisée.
Pendant la différenciation organoïdes, ont montré une épithélialisation plus prononcée semblable aux structures tube-like neurales avec l’espace luminal. En outre, la distribution de diamètre organoïde, était homogène pendant l’engagement cerebellar initial jusqu’au jour 14. L’analyse d’immunofluorescence soutient qu’un engagement neuronal efficace, des organoïdes dérivés d’iPSC, est déjà réalisé, au septième jour de différenciation.
L’immunostaining a également démontré, engagement cerebellar efficace et maturation efficace des organoïdes cerebellar. En outre, après 80 jours dans le bioréacteur, la coloration morte vivante des organoïdes a montré la viabilité élevée de cellules, et aucune évidence des secteurs nécrotiques. Cette technique représente un outil important, pour l’étude des voies pathologiques, impliqué dans la dégénérescence du cerebellar observée dans et pour évaluer l’effet thérapeutique de nouveaux médicaments.
