Cette méthode peut aider à étudier le développement cérébelleux précoce de l’homme et comment il pourrait être modifié dans les troubles neuropsychiatriques. Le principal avantage de cette méthode est de générer des cellules cérébelleuses humaines précoces dans une structure de couche 2D sans effectuer d’étapes compliquées. C’est également rentable.
La fabrication de pipettes à traction peut être délicate au début, mais avec de la pratique et du temps, il devient plus facile de tirer les pipettes d’une manière qui sera plus facile à travailler. Commencez la préparation expérimentale en tirant une pipette Pasteur de 22,9 centimètres à environ deux centimètres sous le cou, au-dessus du brûleur Bunsen pour créer deux pipettes en verre. Le côté le plus mince sera environ quatre centimètres plus court que l’autre.
Pliez les pointes du côté tiré sur la flamme pour créer un R lisse, puis placez les pipettes tirées dans des manchons d’autoclave et stérilisez-les dans un autoclave. Au jour zéro, ajoutez un millilitre de milieu de différenciation cérébelleuse complété par 10 micromolaires Y-27632 et SB-431542 à chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse à six puits, ou ULA, et placez-le dans l’incubateur jusqu’à ce que les colonies levées soient prêtes à être ajoutées aux puits. Nettoyez les cellules différenciées à l’aide d’une pipette en verre tiré.
Aspirer le milieu et ajouter un millimètre de solution de passage iPSC pour chaque boîte de 35 millimètres. Après trois minutes d’incubation à 37 degrés Celsius, aspirer le milieu et ajouter deux millimètres de milieu de différenciation cérébelleuse complété par 10 micromolaires Y-27632 et SB-431542 Sous un grossissement 4x d’un microscope inversé à lumière transmise, soulever les colonies à l’aide du bord courbé de la pipette en verre tiré. Une fois chaque colonie soulevée, transférez doucement toutes les colonies dans un puits de la plaque ULA à six puits à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres.
Répétez ce processus pour chaque plaque iPSC et incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le deuxième jour, ajoutez FGF2 à chaque puits pour ajuster une concentration finale de 50 nanogrammes par millilitre. Le septième jour, changez un tiers du milieu en aspirant un millilitre de milieu usé et en le remplaçant par un millilitre de milieu de différenciation cérébelleuse frais.
Incuber les corps embryoïdes pendant sept jours. Le jour 14, faites tourbillonner l’assiette pour rassembler tous les corps embryoïdes au centre de l’assiette. Ensuite, inclinez la plaque et aspirez tout le milieu usé à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres à partir du bord.
Au fur et à mesure que la quantité moyenne diminue, posez lentement la plaque à plat et continuez à aspirer, en laissant suffisamment de milieu pour éviter d’aspirer les corps embryoïdes. Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu de différenciation cérébelleuse frais complété par 10 micromolaires Y-27632. Ensuite, transférez les corps embryoïdes à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres dans un plat enrobé de poly-L-ornithine laminine.
Le jour 15, aspirez le milieu et remplacez-le par un milieu de différenciation cérébelleuse frais. Le jour zéro, les colonies d’iPSC ont été nettoyées et soulevées dans un milieu de différenciation cérébelleuse contenant SB-431542 et Y-27632 et ont été placées dans des plaques de fixation ultra-basses pour générer des corps embryoïdes. L’ajout de FGF2 le deuxième jour et un changement de milieu de 1/3 le septième jour ont entraîné un élargissement des corps embryoïdes le 14ème jour.
Les cellules ont commencé à migrer vers l’extérieur des corps embryoïdes le long de la surface recouverte le 15ème jour. Le changement complet du milieu à milieu de maturation cérébelleuse à partir du 21ème jour a abouti à une monocouche de cellules avec une morphologie et une complexité de type neuronal au 35ème jour. L’analyse de l’expression génique au jour 35 a révélé que les cellules expriment des marqueurs progéniteurs cérébelleux précoces tels que les progéniteurs glutamatergiques, ATOH1, GABAergic progenitors, PTF1 alpha et les marqueurs cellulaires progéniteurs de Purkinje KIRREL2 et SKOR2.
De plus, l’expression du marqueur labial rhombique OTX2 et principalement du SIX3 spécifique du neurone antérieur ont également été observées. Le marquage immunofluorescent des cellules récoltées le 35e jour a montré une coloration positive pour les marqueurs du cervelet EN2 et PTF1 alpha, le marqueur neuronal bêta tubuline III et le marqueur de prolifération KI67. La coloration nucléaire avec du 4'6-diamidino-2-phénylindole, ou DAPI, a montré des noyaux cellulaires.
Pour une différenciation réussie, il est crucial de commencer par des colonies d’iPSC saines et indifférenciées et d’utiliser des réactifs aussi fraîchement reconstitués que possible.
