Notre protocole combinait plusieurs techniques qui se sont avérées efficaces pour la maintenance organoïde à long terme. Ceci est utile pour étudier le vieillissement dans les maladies liées à l’âge où les manifestations cliniques sont en dehors de la période de développement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite aucun équipement spécialisé ou réactif.
Il est fortement basé sur des matériaux couramment trouvés dans le laboratoire. Le vieillissement et les maladies neurodégénératives sont devenus un point d’intérêt particulier, car nos méthodes de modélisation actuelles se concentrent principalement sur les phénotypes de maladies établis plutôt que sur les premières phases de développement. Les cellules souches embryonnaires et les CSPi sont des cellules très délicates.
Les nouveaux utilisateurs doivent être doux et faire preuve de patience. Comme il s’agit de cultures à long terme, il faut être patient dès le début. Pour commencer, pulvériser 70% d’éthanol sur un brin de suture et préparer des microfilaments PLGA en effilochant le brin de suture avec l’extrémité émoussée du scalpel. Placez la fibre sous un microscope.
Et à l’aide d’une règle, commencez à couper la fibre en fragments de brins de 500 micromètres à un millimètre de long. Coupez environ 25 millimètres de la fibre au total et ajoutez les filaments dans un tube de 15 millilitres contenant un millilitre de solution antibiotique-antimycotique. Ensuite, diluez la solution de fibres avec 10 millilitres de DMEM / F-12 et vortex pour bien mélanger.
Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution de fibres à trois puits d’une plaque de 96 puits. À l’aide d’un microscope à champ clair, comptez et faites la moyenne des fibres par puits. Diluer ou concentrer les puits avec la solution fibreuse à une moyenne de 5 à 10 microfilaments par puits.
Une fois que les cellules souches pluripotentes induites précédemment cultivées ont atteint 70 à 80% de confluence, vérifiez les cellules au microscope à un grossissement de 10 ou 20x. S’assurer que les colonies présentent moins de 10% de zone de différenciation spontanée. Aspirez le milieu avec une pipette et lavez les cellules une fois avec DPBS.
Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution de détachement cellulaire ou 0,5 millimolaire d’EDTA pour dissocier les colonies et incuber à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de média E8 frais à chaque puits et pipette doucement pour détacher toutes les cellules. Transférez toute la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et ajoutez un autre millilitre de média E8 frais.
Ensuite, faites tourner les cellules à 290 g pendant trois minutes à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre du milieu E6 complété par 50 inhibiteurs micromolaires de ROCK et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Préparer une suspension cellulaire de la densité d’assise souhaitée dans un milieu E6 complété par l’inhibiteur ROCK.
Ensuite, ajoutez 150 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse de 96 puits. Ensuite, centrifugez la plaque à 290 g pendant trois minutes à température ambiante pour forcer l’agrégation des cellules. Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5% de dioxyde de carbone pour la formation du corps embryoïde.
Après 24 heures d’incubation, transférer la plaque sur le capot et aspirer soigneusement 120 microlitres du média à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas aspirer le corps embryoïde en abaissant l’extrémité de la pipette trop loin dans le puits. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de milieux E6 frais complétés par deux micromolaires XAV939 et les inhibiteurs SMAD à chaque puits. Transférer la plaque dans l’incubateur et remplacer le milieu quotidiennement par de l’E6 fraîchement préparé complété par les inhibiteurs.
Au septième jour d’incubation, vérifiez si tous les corps embryoïdes ont atteint un diamètre de 550 à 600 micromètres et présentent un bord lisse et clair. À ce stade, ils sont prêts à être intégrés dans une matrice extracellulaire. Pour intégrer les organoïdes, préparez des feuilles d’encastrement alvéolées en plaçant une feuille de film de plafond thermoplastique de quatre pouces de long sur une boîte P200 vide.
Ensuite, utilisez un tube conique de 15 millilitres ou un tube microcentrifuge de 500 microlitres et appuyez doucement sur la feuille de film dans les trous pour faire 12 ou le nombre souhaité de fossettes. Ensuite, vaporisez de l’éthanol à 70% sur la feuille de film et laissez-la sécher à l’intérieur de la hotte avec la lumière UV allumée pendant au moins 30 minutes. Pendant ce temps, décongeler une quantité suffisante de matrice membranaire basale sur la glace.
Ensuite, à l’aide d’une pointe P200 de grand alésage, transférer un corps embryoïde de la plaque de 96 puits à chaque fossette. Retirez autant de média que possible avec un embout de pipette normal, mais ne laissez pas le corps embryoïde sécher. Ensuite, avec un embout P200 pré-refroidi régulier, ajoutez environ 30 microlitres de matrice membranaire non diluée à chaque organoïde, en veillant à ce que le corps de l’embryon soit aussi proche que possible du centre de la gouttelette.
Une fois que tous les corps embryoïdes sont intégrés dans la matrice, placez la feuille de film dans une boîte de Petri stérile. Ensuite, incuber la boîte de Petri à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans une atmosphère humidifiée avec 5% de dioxyde de carbone pour permettre à la matrice membranaire de se solidifier. Pour la différenciation organoïde, ajouter cinq millilitres du milieu de différenciation préparé avec B-27 sans vitamine A à un puits d’une plaque à 6 puits à très faible attache.
Préchauffez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur. Une fois que la matrice membranaire s’est solidifiée, transférer les corps embryoïdes incorporés sur la plaque à 6 puits en poussant les fossettes à l’arrière de la feuille de film. Si nécessaire, utilisez un millilitre de média du puits et placez-le sur la feuille pour détacher les gouttelettes de la feuille de film.
Les corps embryoïdes intégrés dans la matrice membranaire se sont différenciés en organoïdes cérébraux présentant des formations bourgeonnantes distinctes par jour in vitro 10. Au jour in vitro 30, les organoïdes sont encore mûris en utilisant soit une fossette, soit un enrobage sandwich. La culture à long terme montre des organoïdes cérébraux cultivés à des tailles significatives.
Au septième jour in vitro, les corps embryoïdes présentent des rosettes neurales SOX2 positives, des neurones immatures dispersés et des cellules progénitrices neurales. Alors que le jour in vitro 120, ils présentent des marqueurs neuronaux matures tels que MAP2 et NeuN. Ces marqueurs cytosquelettiques peuvent être utilisés en conjonction avec d’autres marqueurs postmitotiques tels que la doublecortine et la synapsine pour sonder la plasticité synaptique et d’autres déclins liés à l’âge, ainsi que des tissus cérébraux supplémentaires comme les astrocytes et la glie.
Il est essentiel de s’assurer que les bords du tissu restent intacts. Pour minimiser la force de cisaillement nocive, la tuyauterie doit être effectuée lentement, par exemple, lors du changement de support et d’encastrement organoïde. Le ralentissement de la croissance organoïde nous permet d’étudier la progression de la maladie dans les manifestations cellulaires précoces.
La création d’organoïdes ouvre la voie à la détection précoce dans le traitement de nombreuses maladies.
