Ce protocole aborde certains problèmes clés existant dans la génération d’organoïdes comme la robustesse et la fiabilité, et nous avons pu appliquer ces organoïdes améliorés à la recherche innovante sur le vieillissement neuronal. L’hétérogénéité et la reproductibilité sont des problèmes importants lors de la génération d’organoïdes cérébraux corticaux. Pour les surmonter, nous différencions d’abord les CSH en colonies neuroectodermiques, puis en sphéroïdes neuro-épithéliaux, qui génèrent une architecture tissulaire reproductible.
Ces organoïdes cérébraux corticaux commencent à présenter des signes typiques de sénescence après une culture in vitro prolongée, ce qui en fait une plate-forme utile pour étudier les processus neuronaux liés au vieillissement. Pour commencer, plaquez les colonies de cSEh sur une matrice de membrane basale qualifiée hESC à partir d’un puits d’une plaque de six puits à 60 % de confluence dans trois puits pour atteindre une densité de 20 à 30 %, puis procédez à l’induction de colonies neuroectodermiques 2D. Ajouter quotidiennement un milieu N2 frais complété par deux inhibiteurs de SMAD à chaque puits pendant les trois prochains jours.
Pour générer des sphéroïdes neuroectodermiques 3D à partir de colonies neuroectodermiques 2D induites, retirez deux millilitres de milieu N2 de la plaque de six puits et lavez-les une fois avec HBSS pour vous assurer que tout le milieu N2 est éliminé. Ajouter un millilitre de dispase à chaque colonie contenant du puits. Incuber la plaque pendant 20 à 25 minutes à 37 degrés Celsius et vérifier régulièrement le détachement de la colonie.
À la fin de l’incubation, pour arrêter l’activité de l’enzyme dispase, ajoutez un millilitre de milieu N2 au puits. À l’aide d’une pointe de pipette P1000 à large alésage ou d’une pointe de pipette P1000 modifiée coupée avec des ciseaux stériles, transférez les colonies dans un tube de 15 millilitres et laissez les touffes de la colonie couler au fond du tube avec gravité. Ensuite, avec une pointe de pipette P1000 standard, retirez soigneusement le surnageant.
Remplacez-le par un millilitre de milieu N2 frais et répétez le lavage trois fois pour assurer l’élimination complète de la dispase. Après avoir remis en suspension les amas cellulaires et le milieu N2, transférer la suspension cellulaire dans un puits d’une plaque de six puits et ajouter 40 nanogrammes par millilitre de bFGF. Après cryosection des organoïdes, retirez l’excès de solution de montage en transférant les lames dans un récipient de coloration à glissière avec un couvercle et lavez le tissu organoïde sectionné trois fois avec du PBS pendant 10 minutes à température ambiante.
Ensuite, incubez les lames pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une solution de coloration à la bêta-galactosidase fraîchement préparée. Lavez les tissus colorés trois fois avec du PBS pendant 10 minutes chacun à température ambiante pour éliminer la solution de bêta-galactosidase. Maintenant, montez les tissus lavés avec un support antifade en verre et laissez la solution de montage se solidifier pendant 30 minutes à température ambiante avant de la visualiser au microscope.
Avant la différenciation neuroectodermique, les colonies de cSEh présentaient une morphologie monocouche plate serrée sans cellules différenciées contaminant les colonies. L’expression de NANOG a également confirmé la pluripotence des colonies de hPSC. Après différenciation des colonies de hPSC en colonies neuroectodermiques, une morphologie en forme de colonne plus longue a été observée, et elles étaient négatives pour NANOG.
Après un traitement par dispase et une exposition au FGF2 dans le N2, les cellules souches neurales de ces sphéroïdes ont proliféré et formé un nombre important de rosettes neurales qui ont démontré la polarité apicale-basale du sphéroïde par expression de Z01 dans les cellules au centre et au bord externe du sphéroïde. Une fois intégré, le sphéroïde prolifère rapidement et commence à bourgeonner, indiqué par la présence des nœuds tissulaires compacts et leur expansion vers l’extérieur du corps principal entre une et trois semaines, ce qui a été confirmé par une analyse quantitative et le diamètre du sphéroïde a considérablement augmenté en trois semaines. La coloration par immunofluorescence a confirmé la présence de cellules neuroprogénitrices et de marqueurs de couche corticale dans les organoïdes avec une stratification claire, ce qui était observable à différents moments.
L’effet des processus liés au vieillissement neuronal sur le cerveau a également été étudié. Avec le temps, une augmentation significative de la présence de bêta-galactosidase associée à la sénescence a été observée et à la semaine 13, la présence de p21 a été détectée, ce qui indique une sénescence. Il est important de s’assurer que tout l’excès de dispase est éliminé et que vous détachez et réensemencez doucement les colonies neuroectodermiques intactes pour former des sphéroïdes sains.
Cette plate-forme de notre opportunité unique d’étudier la biologie d’un vieillissement du cerveau humain, permet également une recherche sur le développement critique du cerveau, à condition que ces organoïdes soient cultivés à l’aide d’un bioréacteur.
