La tolérance thermique est un élément essentiel de la répartition des espèces et des réponses au changement climatique. Ici, nous fournissons des méthodes pour évaluer rapidement la tolérance à la chaleur et au froid chez les petits insectes. Ces méthodes de mesure de la tolérance au froid, par l’intermédiaire du minimum thermique critique et de la tolérance à la chaleur, par le biais du temps d’assaisons par la chaleur sont à haut débit, semi-automatisées et nécessitent un équipement minimal.
David Awde, postdoc de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour configurer un essai minimal thermique critique, alimenter un bain fluide à température contrôlée et appuyer sur le bouton de jeu pour exécuter un programme, augmenter et maintenir la température du bain à 25 degrés Celsius. Attendez cinq à dix minutes pour permettre à la colonne de salle de bains fluide d’atteindre 25 degrés Celsius, avant de remplacer la fiche en haut de la colonne par un filtre de 5,08 centimètres de diamètre.
Appuyez sur environ 40 mouches de leur flacon de nourriture dans la colonne à travers l’entonnoir et remplacez rapidement l’entonnoir par la fiche, en prenant soin de ne pas laisser les mouches s’échapper. Ensuite, laissez les mouches s’installer. Parfois tapant sur la fiche inférieure pour encourager les mouches à grimper.
Après cinq minutes, appuyez sur le bouton de démarrage sur le gain de bain fluide, pour commencer le programme critique de rampement des minima thermiques. Cliquez pour ouvrir le logiciel d’enregistrement de couple thermique sur l’ordinateur et cliquez sur enregistrer pour commencer à enregistrer la température à l’intérieur de la colonne, chaque seconde pour la durée de l’analyse. Assurez-vous que chaque enregistrement de température inclut la lampe de temps spécifique à la seconde, de sorte que les données de température puissent plus tard être fusionnées avec les données du moniteur d’entonnoir Drosophila.
Ajouter cinq millilitres d’éthanol à un tube de centrifugeuse conique de 15 millilitres et placer le tube dans une grille sous la colonne. Appuyez occasionnellement sur le bouchon inférieur de la colonne pour inciter les mouches sur le fond à grimper. La plupart des mouches seront sur un perchoir ou près du sommet de la colonne de 15 degrés Celsius.
À 15 degrés Celsius, placez un entonnoir en verre extérieur de 75 millimètres de diamètre dans le moniteur d’entonnoir Drosophila. Retirez la fiche inférieure et recueillez les mouches encore sur la fiche dans l’éthanol. Ajustez l’anneau de riposte, le moniteur d’entonnoir et l’entonnoir, de sorte qu’ils soient sous la colonne.
Assurez-vous que la lèvre de l’entonnoir scelle complètement le bas de la colonne et insérez le fond de l’entonnoir dans le tube de collecte de 15 millilitres. Ouvrez le logiciel de moniteur d’entonnoir Drosophila. Le logiciel commencera immédiatement à enregistrer l’heure et la date à laquelle les mouches atteignent leurs minima thermiques critiques.
Les mouches qui atteignent leurs minima thermiques critiques, perdront leur fonction neuromusculaire et tomberont de leurs perchoirs, par l’intermédiaire du moniteur d’entonnoir Drosophila. Pour vérifier si toutes les mouches ont atteint leurs minima thermiques critiques, à mesure que la température diminue, vérifiez la prise supérieure et les perchoirs pour voir si des mouches sont encore perchées. Lorsque toutes les mouches ont atteint leur minima thermique critique, déplacez le moniteur d’entonnoir Drosophila et éloignez-vous de l’ouverture de la colonne.
En de rares occasions, les mouches peuvent atteindre leurs minima thermiques critiques, mais restent coincées dans la colonne. Ouvrez la fiche supérieure pour enlever ces mouches. Pour mettre en place une chaleur à haut débit renversé assay, utilisez un aspirateur et couvercle septum, pour charger les mouches sédated dioxyde de carbone individuels, dans chaque puits d’un 96 modifié bien pas de plaque inférieure et sceller la plaque avec un couvercle transparent moulant.
Ensuite, placez l’assiette sur un approvisionnement en nourriture et laissez les mouches s’acclimater à l’assiette du puits 96 pendant au moins 48 heures. Le jour de l’essai, placer l’incubateur à 37,5 degrés Celsius, après 30 minutes placer la plaque de culture de mouche dans l’incubateur avec le fond de la plaque contre le papier blanc sur le fond du plateau. Notez l’orientation des noms de colonne de puits et de ligne sur le plateau et dans le cadre de la webcam et placez du ruban coloré le long des côtés et des bords de la plaque pour aider à vérifier l’orientation.
Lorsque la plaque est en position, fermez la porte de l’incubateur et cliquez sur enregistrer dans le logiciel d’enregistrement vidéo. Après deux heures, vérifiez l’enregistrement pour voir si toutes les mouches ont atteint leur dernier lieu de repos et ont cessé de bouger. Lorsque toutes les mouches ont cessé de bouger, cliquez sur arrêter et jeter les mouches.
Ouvrez le fichier vidéo et enregistrez le temps de knockdown de chaque mouche dans chaque puits. La mesure la plus cohérente du temps d’arrêt de la chaleur entre les essais et les observations est le moment où une mouche atteint son lieu de repos final. Suivez ensuite la vidéo à l’envers, en se concentrant sur un seul puits et en notant l’heure à laquelle la mouche se déplace d’abord hors de son lieu de repos final.
Il peut être difficile de déterminer le temps de repos final de chaque mouche. Pour assurer une analyse précise, il est important de prendre votre temps et d’observer chaque puits individuellement. Dans cette analyse représentative, les femelles de la lignée de panneaux de référence génétique Drosophila avaient des températures thermiques moyennes sensiblement inférieures à celles des femelles de la ligne 714 de la DGRP.
En outre, la chaleur a frappé le temps à 37,5 degrés Celsius, diffèrent considérablement entre les femelles des lignes 73 et 461 DGRP. Avec des modifications mineures, cette méthode pour mesurer la chaleur renversée temps, pourrait être utilisé pour mesurer d’autres traits de tolérance thermique, tels que le temps de récupération froid-coma ou critique maximum thermique. En réduisant considérablement le temps pratique pour les chercheurs, ces méthodes ont permis l’exploration des variations génétiques et des caractéristiques de tolérance thermique à une échelle qui n’était pas auparavant possible.
