Тепловая толерантность является важнейшим компонентом распределения видов и реагирования на изменение климата. Здесь мы предоставляем методы для быстрой оценки тепла и холодной толерантности у мелких насекомых. Эти методы измерения холодной толерантности, через критический тепловой минимум и теплоносимость, через тепло сбил время высокой пропускной способности, полуавтоматические и требуют минимального оборудования.
Демонстрация процедуры будет Дэвид Awde, postdoc из моей лаборатории. Чтобы настроить критический тепловой минимум анализа, питание на температуру контролируемой жидкости ванны и нажмите кнопку воспроизведения для запуска программы, повышение и поддержание температуры ванны до 25 градусов по Цельсию. Подождите от пяти до 10 минут, чтобы позволить колонке жидкости ванной достичь 25 градусов по Цельсию, прежде чем заменить вилку в верхней части колонны с фильтром диаметром 5,08 сантиметра.
Нажмите примерно 40 мух из их пищевой флакон в колонку через воронку и быстро заменить воронку с вилкой, заботясь, чтобы не позволить любой мухи бежать. Затем позвольте мухам осесть. Иногда нажав нижней вилкой, чтобы поощрять мух подняться.
Через пять минут нажмите кнопку пуска на увеличение жидкости ванны, чтобы начать критические тепловой минимы ramping программы. Нажмите, чтобы открыть тепловую пару записи программного обеспечения на компьютере и нажмите запись, чтобы начать запись температуры внутри колонки, каждую секунду в течение всего анализа. Убедитесь, что каждая запись температуры включает в себя таймштамп, специфичный для второй, так что данные о температуре могут быть впоследствии объединены с данными из монитора воронки Drosophila.
Добавьте пять миллилитров этанола 90% в 15-миллилитровую коническую центрифугу и поместите трубку в стойку под колонной. Иногда нажмите нижнюю вилку столбца, чтобы побудить мух на дно, чтобы подняться. Большинство мух будет на окуня или в верхней части колонны на 15 градусов по Цельсию.
При 15 градусах Цельсия поместите стеклянную воронку внешнего диаметра диаметром 75 миллиметров в монитор воронки Дрозофилы. Удалите нижнюю вилку и собирать любые мухи по-прежнему на вилку в этаноле. Отрегулируйте кольцо реторты, монитор воронки и воронку, чтобы они были под колонной.
Убедитесь, что губа воронки полностью уплотняет дно колонны и вставляет дно воронки в 15 миллилитровую трубку сбора. Откройте программное обеспечение мониторинга воронки Drosophila. Программное обеспечение немедленно начнет записывать время и дату, в которые мухи достигают критической тепловой минимы.
Мухи, которые достигают критической тепловой минимы, потеряют свою нервно-мышечную функцию и упадут с окуней, через монитор воронки Дрозофилы. Чтобы контролировать, достигли ли все мухи критической тепловой минимы, по мере снижения температуры, проверьте верхнюю вилку и окуней, чтобы увидеть, если какие-либо мухи по-прежнему сидел. Когда все мухи, достигли своей критической тепловой минимы, переместить монитор воронки Drosophila и воронку от открытия колонны.
В редких случаях мухи могут достигать критической тепловой минимы, но остаются застрявшими в колонне. Откройте верхнюю вилку, чтобы удалить эти мухи. Чтобы создать высокую пропускную способность тепла сбил анализ, использовать аспиратор и перегородки крышкой, для загрузки отдельных двуокиси углерода сеяные мухи, в каждый колодец модифицированных 96 хорошо нет нижней пластины и печать пластины с четкой плотной крышкой.
Затем поместите тарелку на запас пищи и дайте мухам акклиматизироваться к пластине 96 хорошо, по крайней мере 48 часов. В день анализа установите инкубатор до 37,5 градусов по Цельсию, через 30 минут поместите пластину культуры мух в инкубатор с нижней частью пластины на белой бумаге на дне лотка. Обратите внимание на ориентацию колонки и строки имен на подносе и в рамке веб-камеры и поместите цветную ленту по бокам и краям пластины, чтобы помочь проверить ориентацию.
Когда пластина находится в положении, закройте дверь инкубатора и нажмите запись в программном обеспечении видеозаписи. Через два часа проверьте запись, чтобы увидеть, все ли мухи, достигли своего последнего места отдыха и перестали двигаться. Когда все мухи перестанут двигаться, нажмите стоп и распоряжаться мух.
Откройте видео файл и записывают нокдаун время каждой мухи в каждой хорошо. Наиболее последовательной мерой тепла, сбитого между испытаниями и наблюдениями, является время, в которое муха достигает своего последнего места отдыха. Затем отследить видео в обратном направлении, сосредоточив внимание на одной хорошо и увечья время, в котором муха впервые движется покинуть свое окончательное место отдыха.
Определение окончательного времени отдыха каждой мухи может быть трудным. Чтобы обеспечить точный анализ, важно не то время и наблюдать каждый хорошо индивидуально. В этом репрезентативном анализе, женщины из линии генетической справочной панели Drosophila, имели значительно более низкие средние температуры тепловой минимы, чем женщины из линии DGRP 714.
Кроме того, тепло сбил время на 37,5 градусов по Цельсию, значительно отличаются между женщинами от 73 и 461 DGRP линий. С незначительными изменениями, этот метод для измерения тепла сбил время, может быть использован для измерения других термических признаков толерантности, таких как холод-кома время восстановления или критический тепловой максимум. Значительно сократив практическое время для исследователей, эти методы позволили изутовить генетические вариации и черты термической толерантности в масштабах, которые ранее были невозможны.
