A tolerância térmica é um componente crítico das distribuições de espécies e respostas às mudanças climáticas. Aqui fornecemos métodos para avaliar rapidamente o calor e a tolerância ao frio em pequenos insetos. Estes métodos para medir a tolerância ao frio, através do mínimo térmico crítico e tolerância ao calor, através do tempo de calor derrubado são de alto rendimento, semi-automatizados e requerem equipamento mínimo.
Demonstrando o procedimento será David Awde, um pós-doutor do meu laboratório. Para configurar um ensaio mínimo térmico crítico, ligue um banho de fluido controlado pela temperatura e pressione o botão de reprodução para executar um programa, elevando e mantendo a temperatura do banho a 25 graus Celsius. Aguarde de cinco a 10 minutos para permitir que a coluna do banheiro fluido atinja 25 graus Celsius, antes de substituir o plugue na parte superior da coluna por um filtro de 5,08 centímetros de diâmetro.
Toque aproximadamente 40 moscas de seu frasco de comida para a coluna através do funil e substitua rapidamente o funil pelo plugue, tomando cuidado para não deixar nenhuma mosca escapar. Então permita que as moscas se acomodem. Ocasionalmente, toque no plugue inferior para encorajar as moscas a subir.
Após cinco minutos, pressione o botão de partida no ganho de banho fluido, para iniciar o programa crítico de rampa de minima térmica. Clique para abrir o software de gravação de casal térmico no computador e clique em gravar para começar a gravar a temperatura dentro da coluna, a cada segundo durante a duração do ensaio. Certifique-se de que cada registro de temperatura inclua o fuso de tempo específico para o segundo, para que os dados de temperatura possam ser posteriormente mesclados com dados do monitor do funil Drosophila.
Adicione cinco mililitros de 90% de etanol a um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros e coloque o tubo em um rack abaixo da coluna. Ocasionalmente, toque no plug inferior da coluna para atrair qualquer mosca na parte inferior para subir. A maioria das moscas estará em um poleiro ou perto do topo da coluna por 15 graus Celsius.
A 15 graus Celsius, coloque um funil de vidro de 75 milímetros de diâmetro externo no monitor do funil Drosophila. Remova o plugue inferior e colete todas as moscas ainda na tomada do etanol. Ajuste o anel de réplica, o monitor do funil e o funil, de modo que estejam sob a coluna.
Certifique-se de que o lábio do funil sela completamente a parte inferior da coluna e insira a parte inferior do funil no tubo de coleta de 15 mililitros. Abra o software de monitor de funil Drosophila. O software começará imediatamente a gravar a hora e a data em que as moscas atingem seu minima térmico crítico.
Moscas que atingem seu minima térmico crítico, perderão sua função neuromuscular e cairão de suas poltronas, através do monitor do funil Drosophila. Para monitorar se todas as moscas atingiram seu minima térmico crítico, à medida que a temperatura diminui, verifique o plugue superior e os poleiros para ver se alguma mosca ainda está empoleirada. Quando todas as moscas atingirem seu minima térmico crítico, movam o monitor do funil Drosophila e afunilem para longe da abertura da coluna.
Em raras ocasiões, as moscas podem atingir seu minima térmico crítico, mas permanecem presas na coluna. Abra o plugue superior para remover essas moscas. Para configurar um alto nível de calor derrubado, use um aspirador e tampa de septo, para carregar moscas sedadas de dióxido de carbono individuais, em cada poço de uma placa de 96 bem modificada e selar a placa com uma tampa clara e apertada.
Em seguida, coloque o prato sobre um suprimento de alimentos e deixe as moscas se aclimatar ao prato 96 poço por pelo menos 48 horas. No dia do ensaio, coloque a incubadora a 37,5 graus Celsius, após 30 minutos coloque a placa de cultura de mosca na incubadora com o fundo da placa contra o papel branco na parte inferior da bandeja. Observe a orientação da coluna do poço e nomes de linha na bandeja e no quadro da webcam e coloque fita colorida ao longo das laterais e bordas da placa para ajudar a verificar a orientação.
Quando a placa estiver posicionada, feche a porta da incubadora e clique em gravar no software de gravação de vídeo. Depois de duas horas, verifique a gravação para ver se todas as moscas.chegaram ao seu ponto de descanso final e pararam de se mover. Quando todas as moscas pararem de se mover, clique em parar e se livrar das moscas.
Abra o arquivo de vídeo e registe o tempo de knockdown de cada mosca em cada poço. A medida mais consistente do calor derrubado o tempo de inatividade entre os ensaios e observações é o momento em que uma mosca atinge seu ponto de descanso final. Em seguida, acompanhe o vídeo ao contrário, focando em um único poço e observando o tempo em que a mosca primeiro se move para fora de seu ponto de descanso final.
Determinar o tempo final de descanso de cada mosca pode ser difícil. Para garantir uma análise precisa, é importante tomar seu tempo e observar cada um bem individualmente. Nesta análise representativa, as fêmeas da linha de painéis de referência genética Drosophila apresentaram temperaturas de minima térmicas significativamente mais baixas do que as fêmeas da linha DGRP 714.
Além disso, o calor derrubou o tempo a 37,5 graus Celsius, difere significativamente entre as fêmeas das linhas 73 e 461 DGRP. Com pequenas modificações, este método para medir o tempo de calor derrubado, poderia ser usado para medir outros traços de tolerância térmica, como tempo de recuperação do coma frio ou máximo térmico crítico. Ao reduzir significativamente o tempo prático para os investigadores, esses métodos permitiram a exploração de traços de variação genética e tolerância térmica em uma escala que antes não era possível.
