Ces méthodes peuvent être utilisées pour caractériser les réponses au stress chez C.elegans et pour déterminer si les perturbations génétiques ou pharmacologiques affectent l’activation des voies cellulaires protectrices. Ces méthodes permettent des tests rapides et à haut débit de centaines de perturbations telles que le renversement de gènes à la fois sur les niveaux moléculaire et physiologique. Pour s’assurer que l’analyse est effectuée correctement, inclure des contrôles positifs et négatifs.
Synchronisez les animaux sains et bien nourris au bon stade et utilisez des assiettes fraîches pour l’expérience. La visualisation de la micromanipulation des vers à l’aide d’un pic peut aider les nouveaux utilisateurs à comprendre comment les vers peuvent être alignés et évalués pour leur viabilité. Phil Frankino, Holly Gildea et Melissa Metcalf, étudiants diplômés de notre laboratoire, démontreront les procédures.
Utiliser des animaux exprimant le GFP sous le promoteur de la protéine de choc thermique quatre pour l’activation du réticulum endoplasmique a déplié la réponse protéique, cultiver des animaux de reporter synchronisés à 20 degrés Celsius jusqu’au stade L4 et laver les vers de la plaque à l’aide du milieu M9 et transférer dans un tube. Après avoir recueilli les vers par centrifugation, remplacer le M9 par 25 nanogrammes par millilitre du médicament d’intérêt dans M9 ou le sulfure de diméthyle dans M9 dans les tubes animaux de contrôle. Placez ensuite les vers sur une plate-forme rotative pendant trois à quatre heures à 20 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, centrifuger les vers pour qu’ils s’installent avant de remplacer la solution de traitement par 15 millilitres de M9 seulement. Après deux lavages, transférez les animaux dans des plaques NGM ou des plaques d’interférence de l’ARN NGM, le cas échéant, et laissez les vers se rétablir pendant la nuit à 20 degrés Celsius. Lorsque les vers se sont rétablis, ajouter de cinq à dix microlitres d’azide de sodium de 100 millimlaires sur une plaque NGM standard sans bactéries et placer une plaque de vers sous un microscope disséquant.
Transférer 10 à 20 animaux de l’assiette dans l’endroit de l’azide de sodium. Les animaux doivent saisir le mouvement peu de temps après l’atterrissage dans la solution de sel. Une fois que l’azide de sodium s’est évaporé, alignez les animaux dans la configuration d’imagerie désirée avec les côtés antérieur et postérieur dans la même orientation pour tous les animaux et placez immédiatement la plaque des animaux sous un microscope stéréo.
Lancez le logiciel d’imagerie au microscope stéréo et sous l’onglet acquisitions, cliquez sur projets ouverts et dossier pour ouvrir un nouveau projet. Cliquez à droite et sélectionnez renommer pour renommer le dossier. Placez l’échantillon de ver sous l’objectif du microscope et utilisez le réglage Brightfield pour localiser le point focal correct des vers afin de minimiser le blanchiment fluorescent.
Le centre de l’échantillon sera le point où la ligne des œufs est clairement visible et non floue. Définissez le temps d’exposition pour vous assurer que les pixels ne sont pas saturés et aussi pour vous assurer que le signal est au-dessus de la limite de détection. Après avoir con réglage le temps d’exposition, le zoom, la mise au point et les condenseurs Brightfield aux paramètres appropriés, cliquez sur le bouton image de capture pour acquérir une image.
Pour l’imagerie à l’aide d’un microscope composé à champ large, placez la plaque de traitement de contrôle de base sur l’étape du microscope composé à champ large et utilisez la tablette tactile pour lancer le programme de contrôle. Créez un nouvel album et un nouveau nom de fichier et placez la plaque sous l’objectif objectif. Utilisez le contrôle de base et les plaques de contrôle positives pour définir le temps d’exposition et l’intensité de la fluorescence afin que le signal soit visible mais non saturé.
Enregistrez ensuite les images Brightfield et GFP FITC. Pour quantifier l’induction du journaliste par cytométrie du flux de particules, allumez d’abord les lasers cytométriques et ouvrez le logiciel cytomètre. Cliquez sur commencer à activer les lasers dans la fenêtre logicielle et cliquez sur exécuter pour lancer le laser dans la fenêtre popup de contrôle laser argon.
Lorsque le laser atteint environ 12 milliwatts et le niveau de source lumineuse 488 monte à environ 12, cliquez sur fait et vérifiez les quatre valeurs de pression. Si les valeurs ressemblent à celles observées dans la configuration d’origine, cochez la case OK de pression. Ensuite, pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air ou de débris bloquant l’écoulement de la gaine et de l’échantillon à travers la cellule d’écoulement, cliquez propre plusieurs fois.
Puis éteignez le tri et sur la gaine pour redémarrer le flux. Pour vérifier le débit, collectez la gaine pendant 60 secondes. Recueillir la gaine dans un tube de 15 millilitres pendant 60 secondes.
Le débit devrait être de neuf à 10 millilitres par minute. Pour exécuter les échantillons, réglez la puissance du photomultiplier laser à un niveau suffisamment élevé pour que le signal soit au-dessus de la limite de détection, mais pas plus élevé que la limite de saturation. Effectuez des gations de taille pour exclure les bulles, les débris, les œufs et d’autres petites particules indésirables et pour n’inclure que les animaux d’intérêt tels que les adultes.
Lorsque les paramètres de criblage ont été définis, ajoutez les vers préparés à une tasse et cliquez sur acquérir. Veillez à ce que tout le liquide ne soit pas pris dans la machine car cela provoquera le cytomètre d’écoulement à prendre dans l’air et créer des bulles à l’intérieur du détecteur. Lorsque l’échantillon est faible et/ou que suffisamment d’animaux ont été prélevés, cliquez sur arrêter.
Pour stocker les données saisies en fonction uniquement des contraintes de taille, cliquez sur configuration, stockage de données, uniquement fermé, et stocker fermé pour enregistrer les données. Rincez ensuite la tasse de collecte à l’eau déionisée et retirez le lavage par vide trois fois avant de répéter l’analyse avec l’échantillon suivant. Pour mesurer la sensibilité au stress mitochondrial et oxydatif, ajouter de 50 à 75 microlitres de Paraquat dans M9 à huit à 10 puits par condition d’une plaque plate à fond 96 puits et transférer de huit à dix vers par condition à chaque puits de Paraquat.
Toutes les deux heures, appuyez doucement sur la plaque pour faire battre ou plier les animaux vivants afin de permettre de marquer le nombre d’animaux morts par puits. Pour mesurer la sensibilité à la température des animaux, incuber les vers pendant trois à quatre jours à 20 degrés Celsius avant de plaquer de 10 à 15 animaux par plaque par condition pour un total de quatre à six plaques. Placez ensuite les plaques dans un incubateur de 34 ou 37 degrés Celsius et marquez la survie du ver toutes les deux heures comme nous venons de le démontrer.
Le journaliste hsp-4 a une impression basale minimale en l’absence de stress, mais présente une expression GFP robuste lorsque les animaux sont exposés à un stress endoplasmique reticulum en utilisant le médicament Tunicamycin. Ces différences peuvent également être quantifiées à l’aide d’un cytomètre à flux de particules important. En outre, l’induction du transgène sous l’effort endoplasmique de réticulum peut être complètement supressed par knockdown de XBP-1 par l’interférence d’ARN.
Des analyses similaires peuvent être effectuées pour mesurer le stress mitochondrial, le stress oxydatif et le stress thermique. Les réactions physiologiques des animaux entiers au stress peuvent également être mesurées à l’aide de plusieurs tests de survie. Par exemple, l’exposition à la tunicamycine est utilisée pour mesurer la sensibilité au stress réticulum endoplasmique.
Le renversement du gène XBP-1 entraîne une augmentation significative de la sensibilité à la tunicamycine. En outre, l’exposition à l’agent chimique Paraquat est utilisée pour mesurer la sensibilité au stress oxydatif et mitochondrial. Le renversement du gène DAF-2 entraîne une augmentation significative de la résistance au Paraquat.
La thermotolerance peut être mesurée en déterminant la survie des animaux à des températures élevées et peut être tracée comme une courbe de survie. Ces analyses doivent être effectuées au moins quatre à six fois et toutes les répliques doivent être tracées les unes contre les autres, car la thermotolerance démontre une variabilité incroyablement élevée par rapport à d’autres analyses de stress. Lors de l’imagerie des animaux, il est essentiel de définir les paramètres de manière à ce qu’il n’y ait pas de saturation totale ou sous le signal et de s’assurer que les mêmes paramètres sont utilisés tout au long de l’expérience.
Les protocoles d’imagerie décrits ici sont disponibles pour le criblage à grande échelle comprenant des écrans génomiques-larges et sont grands pour des études exploratoires et confirmatoires qui peuvent alors être suivies par les analyses physiologiques décrites.
