La caractérisation des propriétés de transport des thérapeutiques et de leurs transporteurs est essentielle pour assurer des réponses biologiques efficaces. Ces méthodes aident à concevoir des transporteurs de médicaments chargés de façon optimale pour cibler les tissus chargés négativement. Le principal avantage de ces techniques est leur capacité à mieux prédire les efficacités thérapeutiques in vivo grâce à une série d’expériences in vitro qui caractérisent le transport du soluté par les tissus.
Les maladies du cartilage, telles que l’arthrose, ne sont pas traitées en raison de l’incapacité des médicaments à pénétrer dans la matrice dense du cartilage avasculaire, obligeant les transporteurs de médicaments à prologueer l’efficacité thérapeutique. Commencez par utiliser un chiffon de tâche délicat pour enlever doucement l’excès de PBS des surfaces de trois millimètres de diamètre, un millimètre d’épaisseur explantations de cartilage. Utilisez un équilibre pour enregistrer rapidement le poids humide de chaque explant et placez immédiatement les explants dans un bain PBS pour prévenir la déshydratation.
Ensuite, ajoutez 300 microlitres de solution de peptide cationique fraîchement préparée et 30 micromolaires étiquetées fluorescentement par puits aux puits intérieurs d’une plaque de 96 puits et utilisez une spatule pour ajouter une plante à chaque puits de solution. Remplissez chacun des puits environnants de 300 microlitres de PBS et couvrez la plaque d’un couvercle. Sceller les bords de la plaque avec un film flexible pour minimiser l’évaporation et placer la plaque sur un shaker dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 24 heures à 50 révolutions par minute, avec une orbite de 15 millimètres.
À la fin de l’incubation, transférer le bain d’équilibre de chaque puits dans des tubes individuels de polypropylène et faire des dilutions en série à partir du stock 30 micromolaire solution de porteur de peptide cationique pour générer une courbe standard. Ensuite, transférez 200 microlitres de chaque solution et norme dans les puits individuels d’une plaque noire de 96 puits et obtenez des lectures de fluorescence de chaque échantillon et de chaque norme en fonction des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de l’étiquette fluorescente. Pour déterminer la profondeur de la pénétration cationique de porteur de peptide dans une explantation de cartilage, employer un scalpel pour couper six millimètres de diamètre, un millimètre d’épaisseur d’explantations de cartilage dans la moitié et hydrater les morceaux de demi-disque résultants avec l’inhibiteur de protéus complété PBS.
Appliquez l’époxy au centre d’un puits d’une chambre de transport unidimensionnelle conçue sur mesure et fixez une explant à demi-disque dans le puits avec le côté superficiel de l’explant face au côté amont de la chambre. Retirez tout excès de colle du puits pour éviter tout contact avec la surface de diffusion du cartilage et ajoutez 80 microlitres d’inhibiteur de la protéase complétés PBS des deux côtés de l’explantation. Pipette le liquide de haut en bas d’un côté de l’explant pour vérifier la fuite de l’autre côté.
S’il n’y a pas de fuite, remplacer l’inhibiteur de la protéase complété PBS du côté amont par 80 microlitres de 30 micromolaire fluorescence étiquetée solution de porteur de peptide cationique et placer soigneusement la chambre de transport dans un plat de culture cellulaire. Couvrir la base du plat de PBS pour éviter l’évaporation cationique de la solution peptidique. En prenant soin qu’il n’y ait pas de contact direct entre les solutions des chambres en amont et en aval.
Placez le plat couvert sur un shaker pour limiter la sédimentation des particules pendant quatre ou 24 heures à température ambiante et 50 révolutions par minute, avec une orbite de 15 millimètres. À la fin de l’incubation, retirer les explants de la chambre et couper environ 100 microns d’épaisseur du centre de chaque explant. Placez chaque tranche d’explant entre une glissière en verre et un glissement de couverture et hydratez les tranches avec l’inhibiteur frais de protéase complété PBS.
Fixez la diapositive sur la scène d’un microscope confocal et obtenez une pile Z d’images fluorescentes à travers toute l’épaisseur de la tranche au grossissement 10X. Ouvrez le fichier d’image et l’image J, cliquez sur Image et sélectionnez Stacks et Z Project dans le menu dropdown. Ensuite, entrez les numéros de tranche d’une à la tranche finale et sous le type de projection, sélectionnez l’intensité moyenne et cliquez sur Ok.
Pour évaluer le taux de diffusion du cartilage du porteur du peptide cationique non équilibré, assemblez chaque moitié de la chambre de transport, pour inclure un grand joint en caoutchouc, un insert en polyméthylméthacrylate et un petit joint en caoutchouc. Mesurer l’épaisseur d’une explantation de cartilage, puis placer l’explantation dans les puits de l’insert en plastique avec la surface superficielle face à la chambre en amont et sandwich les deux moitiés ensemble pour compléter l’assemblage. Utilisez une clé pour bien visser les moitiés ensemble avant de remplir la chambre en amont avec deux millilitres d’inhibiteur de la protéase complété PBS.
Vérifiez la chambre en aval pour les fuites de la chambre en amont. Si aucune fuite n’est détectée, remplissez la chambre en aval de deux millilitres d’inhibiteur de la protéase complétés PBS. Ajouter une seule mini barre de remue-remuer aux chambres en haut et en aval et placer la chambre sur une plaque de remue-pièce avec la chambre alignée de telle sorte que le laser du spectrophotomètre est concentré vers le centre de la chambre en aval.
Avec la partie récepteur du signal du spectrophotomètre derrière la chambre en aval, recueillez des relevés d’émission de fluorescence en aval stables et en temps réel pendant au moins cinq minutes. Après avoir obtenu une lecture stable, ajoutez un volume pré-calculé de solution de stock de peptide cationique étiqueté fluorescent à la chambre en amont à une concentration finale de trois micromolaires, et surveillez le signal fluorescent en aval tout en permettant au transport soluté d’atteindre une augmentation constante de la pente. Une fois qu’un état stable a été atteint, transférez 20 microlitres de solution de la chambre en amont à la chambre en aval pour un test de pointe et recueillez les lectures en temps réel de fluorescence en aval.
Une charge positive trop élevée limitera la pénétration du soluté à la zone superficielle, car le porteur se lie trop fortement aux groupes aggrecans chargés négativement de la matrice cartilagineux. Inversement, les porteurs qui sont capables de tirer parti des interactions de charge faibles et réversibles pénètrent à travers la zone profonde des tissus. Un porteur de drogue chargé de façon optimale, cependant, non seulement pénétrerait les zones profondes des tissus, mais démontrerait également une absorption intra-tissulaire élevée, qui peut être déterminée en utilisant les mesures de fluorescence du bain d’équilibre et du poids humide de tissu, comme montré.
Les expériences de transport de diffusion non-équilibre aboutir à une courbe générée par des données avec une pente progressivement croissante. La partie initiale de la courbe représente la diffusion soluté à travers le cartilage que les interactions de liaison matrice soluté se produisent. Une fois que les solutés atteignent la chambre en aval, la pente de la courbe augmente à mesure que les lectures de fluorescence augmentent au fil du temps.
Cette deuxième partie de la courbe atteint alors une pente constante, représentant une diffusion régulière de l’état. L’interception X d’une ligne tangentielle tracée à l’état stable de la courbe indique le temps qu’il faut pour atteindre une diffusion régulière de l’état ou un décalage de tau. Après le transfert de solution de l’amont à la chambre aval, on observe une pointe de fluorescence, à partir de laquelle l’intensité stabilisée de fluorescence peut être utilisée pour corréler la fluorescence à la concentration.
La diffusivité effective représentative et les valeurs de diffusion régulières de l’état peuvent ensuite être calculées, comme indiqué. Notez que la diffusion à l’état stable est deux ordres de grandeur supérieurs à la diffusivité effective en raison de l’occupée de tous les sites de liaison basés sur la charge. Ainsi, à ce stade, la diffusion est basée sur la taille et non sur la charge, ce qui entraîne des valeurs de diffusion stables similaires entre les CPC de même taille.
Maintenir l’hydratation des explantations et minimiser l’évaporation des solutions tout au long de l’expérience afin d’éviter les changements dans la morphologie du cartilage et la concentration de la solution, respectivement, et d’assurer l’acquisition de données précises et reproductibles. À la suite de la conception d’un transporteur de drogue chargé de façon optimale, diverses techniques de conjugaison peuvent être utilisées pour modifier les médicaments afin d’améliorer le ciblage tissulaire et de faciliter l’évaluation de leur efficacité biologique.
