Ce protocole présente un flux de travail flexible de PCR de gouttelette de multiplex qui permet le comptage différentiel précis de leukocyte basé sur des marqueurs épigénétiques de méthylation. Cette flexibilité peut faciliter la traduction du mdPCR vers l’utilisation clinique. Cette méthode fournit des résultats qui interrogent étroitement ceux obtenus en utilisant des méthodes de coloration immunofluorescente.
Cependant, contrairement à la coloration immunofluorescente, cette méthode ne nécessite pas d’échantillons de sang frais ou d’anticorps coûteux. Dans les diagnostics hématologiques, le leucocyte différentiel peut servir d’indicateurs pour un spectre de maladies, y compris l’infection, l’inflammation, l’anémie et la leucémie, et est considéré comme un biomarqueur pronostique tôt de cancer. Christina Nassif, agente technique de notre équipe au Centre de recherche sur les dispositifs médicaux du CNRC, fera la démonstration de l’intervention avec Abdelrahman Elmanzalawy.
Commencez par mélanger soigneusement 20 microlitres de protéine kinase K et 400 microlitres de tampon liant de lyse contenant des perles magnétiques avec les cellules mononucléaires périphériques humaines fraîchement décongelées de sang dans 100 microlitres de PBS. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, placer le tube sur une grille magnétique pendant une à deux minutes avant d’enlever le surnatant. Une fois le tube retiré de l’aimant, suspendez à nouveau le complexe de perles d’ADN dans 600 microlitres de tampon de lavage pour enlever les perles non spécifiquement liées.
Remettre le tube sur l’aimant pour permettre l’enlèvement du supernatant, avant de laver les cellules dans 600 microlitres de tampon de lavage deux comme vient de le démontrer. Après avoir enlevé le supernatant, laissez le tube sécher à l’air libre sur l’aimant pendant une minute avant d’ajouter 100 microlitres de tampon d’élitution au tube avec un mélange complet. Ensuite, placez le tube sur la grille magnétique pendant une à deux minutes pour séparer les perles magnétiques de l’ADN mentionné, et transférez la solution d’ADN purifié à un nouveau tube.
Pour la conversion de bisulfite de l’ADN purifié, transférez 20 microlitres de l’échantillon d’ADN mentionné à un tube PCR, et ajoutez 130 microlitres de réaccent de conversion au tube. Après un mélange approfondi, faites tourner brièvement le contenu du tube et amplifiez l’ADN sur un cycleur thermique. À la fin du cycle, ajouter 600 microlitres de tampon liant à une colonne de chromatographie iriontique placée dans un tube de collecte, et ajouter l’ADN à la colonne.
Inverser le tube plusieurs fois pour mélanger, et centrifugeuse pendant 30 secondes à pleine vitesse. Jetez le flux collecté à travers, et ajouter 100 microlitres de tampon de lavage à la colonne. Centrifugez la colonne et jetez à nouveau le flow-through comme démontré.
Ajouter 200 microlitres de tampon de désulfonation à la colonne pendant une incubation de 15 à 20 minutes à température ambiante, avant de centrifuger l’échantillon et de jeter le débit tel que démontré. Ensuite, lavez la colonne deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage par lavage. Après le deuxième lavage, transférer la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre et ajouter 100 microlitres d’eau de qualité PCR à la membrane de la colonne.
Ensuite, élitez l’ADN par centrifugation de la colonne pendant une minute à pleine vitesse. Pour la génération de gouttelettes, mélangez un microlitre d’ADN converti à la bisulfite avec un mélange maître de sonde fraîchement préparé dans un tube PCR, et recueillez l’échantillon avec une brève centrifugation. Utilisez des raccords de pointe pour relier les tubes fluidiques jetables à deux seringues en verre de précision de 250 microlitres.
Et pré-remplir une seringue en verre de précision avec 250 microlitres d’huile porteuse contenant 5% de surfactant flouro, et une seringue en verre de précision avec 50 microlitres d’huile porteuse. Lorsque les deux seringues ont été chargées, chargez 100 microlitres du mélange PCR dans la seringue de l’huile du transporteur et placez un dispositif microfluidique de gouttelette sur la scène d’un microscope à lumière verticale équipé d’une caméra à grande vitesse. Pour l’observation et l’enregistrement de la formation des gouttelettes en temps réel, placez les seringues préfillées sur une pompe à seringues programmable, et utilisez l’union de pointe avec des raccords pour relier le tube des seringues au tube des canaux d’entrée respectifs du dispositif microfluidique de gouttelette.
Placez le tube de la sortie du générateur de gouttelettes à l’intérieur d’un tube PCR de 0,5 millilitre et ajustez le débit de la pompe à seringues à deux microlitres par minute, afin de permettre à la taille de la gouttelette de se stabiliser avant de recueillir l’émulsion qui en résulte. Recueillir lentement et soigneusement l’émulsion du haut du tube, et transférer 75 microlitres de la solution à un tube PCR de 200 microlitres pour le cycle thermique. Ensuite, confirmez que la teneur en huile dans le tube PCR correspond étroitement au volume de la phase dispersée, pour empêcher la coalescence des gouttelettes pendant le cycle thermique, et placez le tube de 200 microlitres dans le cycleur thermique.
Pour l’imagerie par fluorescence de l’échantillon émulsionné, transférez l’émulsion PCR dans un tube capillaire borosilicate profond de 50 micromètres avec un profil rectangulaire, afin de permettre l’arrangement des gouttelettes dans un monocouche emballé près pour l’imagerie. Après avoir fixé et scellé les capillaires sur une lame de microscope, chargez la lame sur la scène du microscope inversé. Et dans le logiciel d’imagerie au microscope, sélectionnez acquérir et vivre rapidement, pour commencer l’acquisition de caméras en temps réel.
Ensuite, observez l’échantillon sous un champ lumineux et une microscopie par fluorescence. Après la production de gouttelettes et le cycle thermique, les gouttelettes peuvent être introduites dans un capillaire en verre d’une largeur d’un millimètre et d’une hauteur de 50 micromètres. Pour obtenir une distribution monocouche des gouttelettes idéale pour l’acquisition d’images de fluorescence, des images peuvent ensuite être enregistrées pour chaque longueur d’onde.
Après analyse d’image, l’intensité de fluorescence de toutes les gouttelettes dans leurs fluorophores respectifs peut être tracée pour établir le seuil des gouttelettes positives et négatives. Après identification et comptage, les copies par gouttelette peuvent être calculées, et le pourcentage de lymphocytes T CD3+, et de lymphocytes T CD4+25+réglementaires peut être déterminé en fonction des copies méthylés de CD3Z et foxp3 respectivement, en ce qui concerne les copies par gouttelette des cellules totales ou du gène sans C. Les valeurs en pourcentage peuvent ensuite être comparées à celles obtenues par imagerie par immunofluorescence à l’aide des anticorps appropriés.
Je pense que la stabilité de l’émulsion de la génération des gouttelettes à travers le cycle thermique et les étapes finales d’imagerie gouttelette est cruciale pour obtenir des résultats de quantification précis, fiables et reproductibles. La personnalisation du PCR MD grâce à une formulation de mélange PCR sur mesure peut être utilisée pour un certain nombre d’applications, y compris la recherche sur le cancer, le diagnostic des maladies infectieuses et l’analyse au niveau d’une seule cellule.
