Nous tenons à souligner le soutien financier du Programme Larkins Monash ainsi que d&#39;un CDF NHMRC et une subvention de projet NHMRC. En outre, nous tenons à remercier Sue Mei Lim pour ses suggestions constructives, Edwina McGlinn pour son soutien et l&#39;équipe Monash Flowcore (en particulier Adam Dinsdale) pour leur aide dans la production de la vidéo.

1 Instrument Settings / Préparation des réactifs / Génotypage <ol><li> Préparer le milieu de cellules iPS: Supplément de 500 ml Knockout milieu DMEM avec du sérum 75 ml fœtal bovin (FBS), 5 ml de L-glutamine, 5 ml acides aminés non essentiels, 500 pi β-mercaptoéthanol, 5 x 10 5 unités leucémie facteur inhibiteur ( FRV). S&#39;il vous plaît se référer à la liste des matériaux pour le produit et les informations d&#39;achat pour les réactifs utilisés dans le cadre de ce manuscrit. </li><li> Préparer le milieu MEF: Supplément de 500 ml du milieu DMEM avec 50 ml de FBS, 5 ml de L-glutamine, 5 ml acides aminés non essentiels, 5 ml de pyruvate de sodium, 500 pi β-mercaptoéthanol. </li><li> Préparer le milieu de congélation: Pour 10 ml, mélanger 9 ml de FBS avec 1 ml de DMSO. </li><li> Préparer la gélatine enduite plats Ajouter une solution de gélatine porcine 5.3 ml à 0,1% pour un flacon T75, incuber à température ambiante pendant au moins 10 min et aspirer juste avant utilisation. </li><li> Préparer milieu de marquage FACS: Pour 10 ml, mélanger 9,9 ml de PBS avec 0,1 ml de FBS. </li><li> Effectuerun génotypage par PCR pour le locus Rosa26 m2rtTA: Effectuer des réactions avec l&#39;ADN polymérase Taq selon les instructions du fabricant. Utilisez une modification de MgCl2 -concentration de 3,5 mM et les trois amorces suivantes: oIMR8052: 5 &#39;GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3&#39;, oIMR8545: 5&#39;AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 &#39;, oIMR8546: 5&#39; GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 &#39;. Les conditions de cyclage: 94 ° C pendant 3 min; 35 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 65 ° C pendant 1 min, 72 ° C pendant 1 min); 72 ° C pendant 2 min; maintenir à 12 ° C. La taille du produit attendu: 650 pb pour l&#39;allèle sauvage et 340 pb pour l&#39;allèle mutant. </li><li> Effectuez une PCR génotypage du locus collagène StemCa / OKSM: Effectuer des réactions avec l&#39;ADN polymérase Taq selon les instructions. Utilisez une modification de MgCl2 -concentration de 2,5 mM et les trois amorces suivantes: col / frt-B: 5 &#39;CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3&#39;, col / frtA1: 5 &#39;GCACAGCATTGCGGACATGC 3&#39;, col / frtC1: 5 &#39;GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 &#39;. Les conditions de cyclage: 95 ° C pendant 1 min: 2 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 70 ° C pendant 45 s), 6 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 68 ° C pendant 45 s) et 30 cycles de (94 ° C pendant 20 s, 60 ° C pendant 1 min); 72 ° C pendant 5 min; maintenir à 12 ° C. La taille du produit attendu: 331 pb pour l&#39;allèle sauvage et 551 pb pour l&#39;allèle mutant. </li><li> Effectuer toutes les étapes de centrifugation à 400 g pendant 3 min à 4 ° C. </li></ol> 2. génération de fibroblastes embryonnaires de souris <ol><li> Effectuer un calage entre l&#39;accouplement d&#39;un animal de la souche OKSM avec un membre du sexe opposé de la souche m2rtTA. Embryons de récolte au jour embryonnaire 13,5 par l&#39;abattage de la mère et de retirer la corne utérine. Avant l&#39;enlèvement de la corne utérine, de pulvérisation de la région abdominale avec une solution d&#39;éthanol à 80%, pour éviter une contamination microbienne. </li><li> Transférer la corne de l&#39;utérus dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Utilisez des ciseaux de qualité chirurgicale stérilisés pour couper la corne utérine en morceaux contenant un embryon (voir la figure 3A, B). </li><li> Utiliser un microscope de dissection (idéalement placé au sein d&#39;une culture capot de tissus) et des pinces stérilisées à retirer soigneusement l&#39;enveloppe de l&#39;utérus et les membranes extra-embryonnaires entourant chaque embryon. Transférer chaque embryon à une boîte de 10 cm séparée avec 10 ml de PBS. </li><li> Procédez en supprimant la tête de l&#39;embryon, les membres, la queue et les organes internes (coeur, foie, intestin etc) avec la pince (voir la figure 3C). Transférer la tête de l&#39;embryon dans un tube de 1,5 ml et congeler le bas de sorte qu&#39;il peut être utilisé pour le génotypage si nécessaire. </li><li> Transférer le torse de l&#39;embryon dans un 10cm assiette vide et utiliser deux lames chirurgicales pour hacher l&#39;embryon pendant 2 min. Ajouter 200 ul de solution de trypsine / EDTA au-dessus de l&#39;embryon hachées et incuber pendant 3-5 min à température ambiante. Continuer hachage pour 2 min, ajouter 2 ml de milieu MEF à l&#39;<html> activer la trypsine, puis les transférer dans un tube de 15 ml. </li><li> Utiliser une pipette de 1000 pi de dissocier davantage mécaniquement le tissu léger pipetage. Transfert à une gélatine recouvert de 10 cm et d&#39;ajouter un montant supplémentaire de 10 ml de milieu MEF. Remarque: Les deux incubateurs normoxiques et hypoxiques peuvent être utilisés pour la culture, se réfèrent à la discussion pour plus d&#39;informations. </li><li> Après 24-48 heures, la plaque doit être densément couvert MEF. </li><li> Alternativement, les cellules peuvent ensuite être propagées ou congelées. Pour la congélation de cellules, retirez le support de culture, rincer le plat avec 10 ml de PBS pour éliminer les traces de médias et de superposition avec 3 ml de trypsine solution / EDTA. Incuber pendant 3 à 5 min à 37 ° C, l&#39;inactivation de la trypsine digestion en ajoutant 5 ml de milieu et de transfert MEF à un tube de 15 ml de centrifugation. Isoler et remettre en suspension le culot dans 3 ml de gel médias. Transfert à 3 cryotubes et congeler dans un récipient de congélation de cellules. </li></ol> 3. reprogrammation de MEF ove_content &quot;&gt; NOTE: cellules pellets par centrifugation à 200 g pendant 5 min à 4 ° C et utiliser normoxiques incubateurs de culture de tissus pour la reprogrammation Il peut être bénéfique de tirer et d&#39;élargir MEF dans des conditions hypoxiques (5% d&#39;oxygène, voir la discussion pour plus d&#39;informations. ). <ol><li> Décongeler rapidement un cryovial faible passage (P0-P1, 2-3 cellules Mio) dans un bain d&#39;eau (37 ° C) et transférer le contenu dans un tube de 10 ml de milieu MEF préchauffées. Cellules à granules, remettre en suspension dans les médias MEF 12 ml fraîches, transférer dans un récipient de culture T75 de gélatine appliquée, et permettent aux cellules de récupérer pendant 24-48 heures avant de continuer. Remarque: MEF peuvent également être utilisées directement après dérivation. </li><li> Après l&#39;élimination du milieu de culture, le lavage avec du PBS et les MEF cellularize par superposition avec une solution de trypsine / EDTA (3 ml de 3-5 min à 37 ° C). Étancher la trypsine en ajoutant 5 ml de milieu MEF et dissocier en outre des cellules par un mélange doux avec une pipette de 10 ml. Déterminer le nombre de cellules en utilisant un hématimètre. </li><li> Pour reprograexpériences mming, MEF de semences SUR DES gélatine enduit flacons T75 à des densités de 6,7 x 10 3 cellules / cm 2 (~ 0,5 Mio cellules par flacon) dans les médias iPSC contenant 2 pg / ml de doxycycline. Reportez-vous au tableau 1 concernant les recommandations de semis pour obtenir environ 2 Mio intermédiaires de reprogrammation pour chaque point de temps. Remarque: La reprogrammation commence avec l&#39;addition de doxycycline (2 pg / ml) additionné médias </li><li> Pour les 6 premiers jours remplacent les médias tous les jours avec de la doxycycline frais complété médias iPSC (12 ml de milieu par flacon T75). Au-delà de ce point renouveler multimédia sur une base quotidienne s&#39;il existe un grand nombre de cellules. Doubler le volume de la culture si les changements de supports ne peuvent être effectuées tous les deux jours. </li><li> Intermédiaires de récolte de reprogrammation aux points de temps requis (suggestion: Jours 3, 6, 9, 12) en supprimant les médias, le rinçage avec un volume approprié de PBS (10 ml pour un flacon T75) et recouvrant avec une solution de trypsine-EDTA (3 ml pour un flacon T75). Incuberpour 3-5 min à 37 ° C et éteindre en ajoutant 5 ml d&#39;iPSC médias suivis par pipetage doux. </li><li> Comptez suspension de cellules avec un hémocytomètre (voir ci-dessus), culot par centrifugation, aspirer les cellules surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de PBS pour éliminer toute trace de la trypsine. Pellet les cellules une fois de plus, aspirer le surnageant et passez à l&#39;étape 4.1 pour isoler les intermédiaires de reprogrammation. Remarque: Les cellules subissant reprogrammation peuvent être cryoconservés et décongelés pour FACS isolement à un stade ultérieur. </li><li> Pour établir iPS cultures entièrement reprogrammées, cultiver des cellules en libre-dox iPSC médias pour une période de 4-7 jours. Remarque: les cultures de reprogrammation succès contiennent un grand nombre de colonies par jour 12 (voir Figure 4). Pendant ce temps, les cellules iPS aberrantes qui nécessitent encore l&#39;expression OKSM disparaîtront. </li><li> Sinon, pour propager les autres entièrement reprogrammées iPS cultures: d&#39;abord, les semences MEF irradiés à une densité de 15 x 10 3 cellules / cm 2 </sjusqu&#39;à&gt; dans 12 ml d&#39;iPSC support sur un enduit de gélatine T75 ballon d&#39;un jour ou 6 heures avant les expériences. </li><li> Ensuite, cellularize cultures de cellules iPS en supprimant les médias, le rinçage du flacon T75 avec 10 ml de PBS, la superposition avec 3 ml de solution de trypsine-EDTA et incubation pendant 3 à 5 min à 37 ° C. Étancher la trypsine en ajoutant 5 ml de milieu iPSC suivis par un mélange doux, transférer dans un tube conique de 15 ml, centrifuger, puis remis en suspension dans 10 ml iPS médias. </li><li> Transférer 500 ul de cette suspension cellulaire sur les FAE irradiés (flacon T75) et de permettre aux cultures de se développer pendant 4-5 jours. Remarque: iPS établies cultures peuvent être cryoconservés ou utilisés pour des expériences. Les lignées cellulaires clonales sont obtenues par prélèvement de colonies individuelles iPSC sous un microscope de dissection 22. </li><li> Cryo préserver les cultures confluentes iPSC comme décrit à la section 2.8 pour MEF. </li></ol> 4. Anticorps étiquetage <ol><li> Remettre en suspension les culots de cellules de cultures de reprogrammation, tels que préparés à la section 3, dansFACS support d&#39;étiquetage complété avec des anticorps (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotine 1: 400 et anti-EpCam Fitc 1: 400). Utilisez 200 pi de mélange complété d&#39;étiquetage par 5 millions de cellules et incuber sur de la glace. </li><li> Après 10 min tapotez doucement le tube pour remettre en suspension les cellules et incuber pendant 10 minutes de plus sur la glace. Ajouter 10 ml de PBS froid par tube et centrifuger. </li><li> Pour chaque tube à teindre préparer 200 pi de support d&#39;étiquetage complété avec 1 pi de streptavidine PeCy7 (1: 200) par 5 millions de cellules. Lorsque les cellules ont granulés, aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension dans un volume approprié de support d&#39;étiquetage complétées par streptavidine-PeCy7. </li><li> Gardez cellules sur de la glace pendant 10 minutes, appuyez sur pour remettre en suspension, incuber pendant 10 minutes sur la glace, ajouter 10 ml de PBS froid par tube, un spin et aspirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les culots cellulaires dans des milieux complétés de marquage l&#39;iodure de propidium (PI) (2 pg / ml) à environ 1 x 10 7 cellules / ml. Retirer amas de cellules en faisant passer la suspension à travers un tamis de 70 um. Transférer les cellules dans un tube FACS appropriée et de les garder sur la glace. </li><li> Préparer les échantillons séparés avec les différents anticorps (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 et anti-EpCam). NOTE: Ce sont nécessaires pour effectuer une compensation de la couleur dans les trois canaux utilisés dans l&#39;analyse. En outre, les cellules non marquées sont nécessaires pour établir des tensions et des portes pour le tri. Idéalement cellules iPS sont utilisés pour la compensation: les stocks de 0,5-1 x 10 6 cellules iPS entretenus sur MEF irradiés sont stockés dans des cryotubes dans l&#39;azote liquide. La présence de MEF est essentiel pour obtenir un signal dans le canal Thy-1.2. </li><li> Décongeler un tube cryogénique des cellules iPS comme décrit pour les FAE (section 3). Après la centrifugation, remettre les cellules dans 800 ul de tampon de marquage et 200 ul de cet échantillon est mis de côté en tant que témoin non marqué. </li><li> Utilisez les cellules restantes en tant que témoins de rémunération. cellules Diviser entre trois tubes de 15 ml et ajouter anticorpscomme suit: Pacific Blue commande de compensation: ajouter 0,5 pi de l&#39;anticorps anti-Thy-1.2 Pacific Blue. Tube de compensation Fitc: ajouter 0,5 pi de l&#39;anticorps anti-EpCAM-FITC. Pe-Cy7 commande de compensation: 0,5 pi de l&#39;anticorps anti AESS-1-biotine. </li><li> Conserver les échantillons de cellules-anticorps sur la glace pendant 10 min, mélanger en tapotant et incuber pendant 10 min sur la glace. </li><li> Échantillons lavage avec 10 ml de PBS froid pour éliminer les anticorps non liés, tournent cellules vers le bas et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les culots cellulaires dans 200 pl de substrat d&#39;étiquetage FACS. </li><li> Pour les anti-SSEA-1-biotine échantillons marqués, ajouter un conjugué streptavidine-PeCy7 (1 pi par 200 pi de cellules). cellules d&#39;étiquetage tels que décrits pour l&#39;anticorps primaire (AESS-1-biotine). </li><li> Faire passer tous les échantillons y compris le contrôle non marqué à travers un tamis de 70 um et ajouter PI (2 pg / ml). Transférer les cellules dans des tubes FACS et garder sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> 5 FACS isolement d&#39;intermédiaires Remarque:Les cellules sont triées à l&#39;aide d&#39;une fluorescence Activé Cell Sorter avec 405 nm, 488 nm et 560 nm lasers d&#39;excitation et une buse de 100 um. <ol><li> Mettre en place des tensions de diffusion vers l&#39;avant et sur le côté de sorte que la population de cellules est visualisée correctement. Dessiner une grille autour des cellules, comme indiqué sur la figure 5A pour exclure les débris. Remarque: La bonne mise en place de tensions sur le trieur de cellules peut être complexe et nécessite un opérateur expérimenté FACS. </li><li> Utilisez diffusion vers l&#39;avant (FSC) de hauteur par rapport à la zone CFA d&#39;exclure agrégats (Figure 5B). </li><li> Visualisez la chaîne de PI en fonction de FSC à porte dans les PI cellules vivantes négatifs (figure 5C). </li><li> Utilisez les cellules non marquées pour régler les tensions pour les canaux de fluorescence de PB, Fitc / GFP, Pe-Cy7. Idéalement positionner la population de cellules à l&#39;extrémité inférieure du canal respectif. </li><li> Set portes avec des cellules témoins non marqués comme le montre la figure 6A, B à la sous-fraction de culte de reprogrammationures en jour 3, 6 et 9 populations: l&#39;AESS-1-/ Thy-1.2 + cellules; AESS-1 / Thy-1.2- cellules; et la reprogrammation d&#39;intermédiaire pour l&#39;AESS-1 + / Thy-1.2- cellules. </li><li> Subdiviser la Journée 9 AESS-1 + / Thy-1.2-fraction en utilisant le Pe-Cy7 contre Fitc blot; établir des barrières autour du Sse-a1 + / EpCam + cellules et les cellules de l&#39;AESS-1 + / Epcam-. Set portes avec des cellules témoins non marqués comme le montre la figure 6C, D. </li><li> Pré-remplir des tubes de collecte appropriés avec les médias de cellules iPS (1-2 ml) avant de trier les sous-populations souhaitées (voir Figure 7 pour les profils FACS représentatifs des MEF, Jour 3 / Jour 6 / Jour 9 / Jour 12 cultures et des cellules iPS). </li><li> Effectuer FACS tri selon fabrique protocole. </li><li> Après FACS isolement soumettre les cellules à un profilage moléculaire (ARN / extraction de protéines, immunoprécipitation de la chromatine, l&#39;ADN méthylome analyse etc). En variante, les différentes fractions cellulaires peuvent être mises en culture. </li></ol>

<ol>
	<li>Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotential+embryonic+stem+cells+from+murine+primordial+germ+cells+in+culture.">Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture.</a> Cell. 70, 841-847 (1992).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reprogrammable+mouse+strain+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells.">A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 7, 53-55 (2010).</li><li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+and+drug+screening:+opportunities+and+challenges.">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+iPSC+model+of+Hutchinson+Gilford+Progeria+reveals+vascular+smooth+muscle+and+mesenchymal+stem+cell+defects.">A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects.</a> Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).</li><li>Samavarchi-Tehrani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+reveals+a+BMP-driven+mesenchymal-to-epithelial+transition+in+the+initiation+of+somatic+cell+reprogramming.">Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).</li><li>Celi&#224;-Terrassa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+can+suppress+major+attributes+of+human+epithelial+tumor-initiating+cells.">Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849 (2012).</li><li>Liao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+cluster+302&#8211;367+enhances+somatic+cell+reprogramming+by+accelerating+a+mesenchymal-to-epithelial+transition.">MicroRNA cluster 302&#8211;367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).</li><li>Cie&#347;lik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+coordination+of+signaling+pathways+during+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition.</a> Epigenetic., &amp; Chromatin. 6, 1-22 (2013).</li><li>Golipour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+transition+in+somatic+cell+reprogramming+requires+regulators+distinct+from+the+pluripotency+network.">A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network.</a> Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+molecular+cornerstones+during+fibroblast+to+iPS+cell+reprogramming+in+mouse.">Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse.</a> Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).</li><li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+mouse+somatic+cells.">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li><li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Polo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+roadmap+of+reprogramming+somatic+cells+into+iPS+cells.">A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells.</a> Cell. 151, 1617-1632 (2012).</li><li>Wright, A. J., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+marker+antigens+in+the+characterization+of+human+embryonic+stem+cells.">Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).</li><li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells.">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. , (2013).</li><li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+coordinated+proteome+dynamics+during+reprogramming+of+somatic+cells+to+pluripotency.">Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency.</a> Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+molecular+cornerstones+during+fibroblast+to+iPS+cell+reprogramming+in+mouse.">Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse.</a> Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reprogrammable+mouse+strain+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells.">A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 7, 53-55 (2009).</li><li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette.">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li><li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells.">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, 1145-1148 (2009).</li><li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells.">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).</li><li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Pour reprogrammer avec succès MEF en cellules iPS et de purifier les intermédiaires de reprogrammation à grande quantité, il est essentiel d&#39;être conscient des facteurs qui ont un impact sur l&#39;efficacité globale. En particulier, le lot de FBS utilisée pour compléter médias iPS peuvent avoir un effet néfaste. Dans des expériences positives générales ont été faites avec des souches embryonnaires (ES) cellules FBS qualifiés, mais le contrôle par lot de sérums à partir d&#39;une variété de fournisseurs pourrait identifier une alternative moins chère. Un autre facteur qui influe sur l&#39;efficacité de la reprogrammation est le génotype de 15,20 MEF. Bien MEF provenant de souris hétérozygotes (het) à la fois pour la OKSM et le lieu m2rtTA ne reprogrammer, homozygousity à un ou deux résultats loci dans de meilleurs rendements de reprogrammation. En effet, MEF issus de la progéniture de OKSM et m2rtTA croix montrent une augmentation de l&#39;efficacité de la reprogrammation dans l&#39;ordre suivant (OKSM / m2rtTA): het / het &lt;homo / het &lt;het / homo &lt;homo /homo (s&#39;il vous plaît noter que les chiffres donnés dans le tableau 1 pour les animaux het / het). A l&#39;occasion rare d&#39;un homme homo / homo animal est identifié, un harem à s&#39;accoupler avec plusieurs femelles m2rtTA peut être mis en place. Toute la progéniture de ces croisements sera Het / homo pour la OKSM / m2rtTA loci, respectivement. En outre, le génotypage rapide des portées est recommandé que des portées plus importantes sont obtenues lors de l&#39;utilisation pour la reproduction des souris jeunes (6-15 semaines d&#39;âge). De plus, l&#39;utilisation de MEF de passage faible pour la reprogrammation est souligné 23. Si MEF ont été obtenues et développées dans un normoxique incubateur de culture de tissu, nous vous recommandons fortement d&#39;utiliser uniquement ces cellules à passage 2 Toutefois, si l&#39;expérimentateur a accès à un incubateur faible teneur en oxygène (5% d&#39;oxygène) pour le calcul et l&#39;expansion de la FAE, numéros de passage aussi élevées que 3 sera toujours donner de bons résultats 23. Dans le cas où l&#39;expérimentateur rencontre des problèmes liés à la reprogrammation,<html> comme il est indiqué, les explications les plus probables sont des nombres élevés de passage au moment de l&#39;addition de dox, le génotype des souris incorrect ou l&#39;utilisation de FBS qui n&#39;est pas propice pour la production de cellules iPS. Cependant, dans de rares cas, nous avons observé que les MEF ne sont pas en mesure de reprogrammer même dans des conditions idéales. Dans ces cas, une deletion spontanée de novo au sein de cadre de lecture ouvert de la m2rtTA a été identifié comme la cause sous-jacente. Cette méthodologie a été adaptée avec succès pour extraire l&#39;AESS-1 + intermédiaires via l&#39;isolement cellulaire magnétique (MACS). Il ya un avantage de temps évident à recourir MACS, cependant, la pureté des AESS-1 + populations de cellules est réduit à 80-90%, plutôt que plus de 95%, ce qui selon le type d&#39;expérience, les cellules sont destinées à risque de poser un problème. Ainsi, une option est d&#39;utiliser MACS pour enrichir l&#39;AESS-1 + cellules suivie par FACS pour augmenter la pureté et / ou fraction-les dans l&#39;AESS-1 + / + et EpCam AESS-1 cellules + / Epcam-. &quot;&gt; Alors que les cellules iPS produits par le protocole décrit et le modèle de la souris a été démontré que d&#39;être pluripotentes et contribuer efficacement à tous les tissus des animaux chimériques 15,20, une réduction de la capacité à produire des embryons entièrement composés de ces cellules iPS via la complémentation est tétraploïde démontré 24. profils de méthylation aberrants au groupe de gènes DLK-DIO3 ont été identifiées comme la cause sous-jacente 24. Cependant, l&#39;addition d&#39;acide ascorbique à une concentration de 50 pg / ml à la presse lors de la reprogrammation produira complémentation tétraploïde iPS compétentes cellules 24. S&#39;il vous plaît noter que le modèle de la souris reprogrammable alternatif conçu pour exprimer les facteurs de reprogrammation à une stoechiométrie différente peut produire tétraploïdes cellules iPS compétentes, même en l&#39;absence de traitement à l&#39;acide ascorbique 25. Cependant, dans nos cellules mains de cette souche reprogrammer à considérablement plus basse fréquence par rapport pour le mode de la souris utilisé icil. La méthodologie décrite dans ce manuscrit permet la séparation des intermédiaires de reprogrammation de la masse réfractaire de la population et doit être considéré comme un outil précieux pour disséquer et comprendre le processus de reprogrammation, la suppression des limitations précédentes d&#39;avoir à utiliser une population non fractionnée pour le profilage (par exemple, bruit du signal haute à partir des cellules réfractaires). La combinaison de l&#39;anticorps décrit ci-après permet l&#39;isolement de produits intermédiaires à partir de cellules de souris à pureté élevée, mais il est possible que les marqueurs de surface des cellules supplémentaires seront découverts dans le futur qui permettra d&#39;obtenir des produits intermédiaires à une pureté encore plus élevée. S&#39;il vous plaît noter que l&#39;AESS-1 expression n&#39;est pas une caractéristique des cellules souches pluripotentes humaines induites et si bien que ce protocole ne peut pas être utilisé sur la reprogrammation des cellules d&#39;origine humaine. En conclusion, la reprogrammation des intermédiaires isolés fois avec la méthode décrite peuvent être utilisés pour les analyses moléculaires dont l&#39;expression profilineg, immunoprécipitation de la chromatine, méthylome analyse, et de protéines essais.

Des cellules souches embryonnaires (ES) sont dérivées à partir de la masse cellulaire interne d&#39;embryons au stade de blastocyste 1. Dans des conditions de culture appropriées, ils s&#39;auto-renouveler et restent pluripotentes. En 2006 Yamanaka et ses collègues ont démontré que les cellules matures peuvent être reprogrammées en dite souches pluripotentes induites cellules (iPS) par l&#39;expression forcée de facteurs de transcription Oct-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) 2. cellules iPS, comme les cellules ES, peuvent donner lieu à tous les types de cellules du corps, cependant, ils sont libres des contraintes éthiques liées à la génération de cellules ES 3. En outre, les cellules iPS portent la promesse de la médecine régénérative personnalisée et un potentiel énorme pour les applications telles que la modélisation de la maladie et dans la drogue vitro de dépistage 4,5. Pour reprogrammer la technologie pour réaliser ce potentiel, le mécanisme de base de reprogrammation nucléaire doit être pleinement compris. Cependant, les efforts de disséquer la pat de reprogrammationHway ont été entravés par le fait que seul un très petit nombre de cellules reprogrammer (0,1-1%). Fibroblastes reprogrammation succès ont été rapportés à subir une série distincte d&#39;événements, dont un mésenchymateuses de la transition épithéliale 6-10 et, dans les dernières étapes de la reprogrammation, l&#39;activation du réseau de la pluripotence de base endogène 11-14. Nous et d&#39;autres 12,13,15-17 avons récemment identifié une série de marqueurs de surface cellulaire qui permet la séparation de produits intermédiaires à partir de la population de rares masse réfractaire. Reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) subissent des changements dans l&#39;expression de Thy-1.2, SSEA1 et EpCam (entre autres) au cours du processus de reprogrammation 15 2-semaine. Tôt au cours reprogrammation d&#39;un sous-ensemble de MEF réguler à la baisse l&#39;expression d&#39;un marqueur de l&#39;identité des fibroblastes (Thy-1.2) et commencez à exprimer le marqueur de pluripotence associée AESS-1 12. Au cours des dernières étapes de la reprogrammation des cellules SSEA1 positifs reACTIVmangé gènes de pluripotence endogènes comme Oct-4 10-13,15. Cette dernière transition est marqué sur la surface de la cellule par l&#39;expression détectable de EpCAM (voir la figure 1) ou dans une étape ultérieure Pecam 15. Récemment, O&#39;Malley et al. Rapporté l&#39;utilisation de CD44 et ICAM1 comme des alternatives ou complémentaires à Thy-1.2 et l&#39;AESS-1 pour l&#39;identification des intermédiaires de reprogrammation. Nous avons déjà FACS extrait intermédiaires de reprogrammation de jours 0, 3, Jour 6, cultures Jour 9 Jour 12 et reprogrammation, ainsi que de lignées cellulaires iPS établies sur la base de ces marqueurs de surface cellulaire 15,18. Pour que le système et les conditions de reprogrammation décrit ci-dessous, nous avons montré au niveau de la cellule unique, bien que les populations sont calmes homogène, il ya un certain degré d&#39;hétérogénéité dans les populations intermédiaires identifiés. Il convient de noter que seul un sous-ensemble de cellules au sein de ces populations sont en mesure de passer à la prochaine sta respectivege du processus de reprogrammation et de donner naissance à des colonies de cellules iPS à des rendements différents, qui ont été largement caractérisées auparavant 15,19. En outre, l&#39;efficacité de la reprogrammation de ces populations dépend aussi bien sur les conditions re-placage et de la culture. Pour augmenter la reproductibilité expérimentale on utilise une souche de souris reprogrammable qui a été conçu pour exprimer un transactivateur transcriptionnel (m2rtTA) sous le contrôle du locus Rosa26 et une cassette d&#39;OKSM polycistronique sous le contrôle d&#39;un promoteur sensible à la doxycycline 20,21. L&#39;utilisation de ce modèle de souris évite les effets secondaires indésirables des procédés traditionnels de production virale des cellules iPS, à savoir, une population hétérogène de départ de cellule à cellule dans la variabilité du nombre et de l&#39;emplacement des sites d&#39;intégration des inserts viraux. Deux souches de souris transgéniques (OKSM, m2rtTA), disponibles comme animaux homozygotes fondateurs du Laboratoire Jackson, doivent être franchi en vue d&#39;établir la reprogramodèle de souris mmable (voir Figure 2). Dans ce manuscrit, nous décrivons en détail comment obtenir MEF, générer des cellules iPS, et isoler les intermédiaires de reprogrammation à différents stades du processus de conversion par FACS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">48-0902-82&#160;</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">13-8813&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Streptavidin PE-Cy 7&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">25-4317-82&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti- Mouse CD326(Epcam) Fitc&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">48-5791-82&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11360-070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11140-050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td dir="LTR" height="25" style="height:25px;width:212px;">Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">25200-056&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">GlutaMAX</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">35050-070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">21985-023&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DMSO (Dimethyl Sulfoxide)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">D8418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Propidium Iodide solution (PI)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">P4864-10ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Gelatine from porcine skin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">G1890&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Doxycyclin hyclate&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">33429-100MG-R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Leukemia Inhibitory Factor (LIF)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Millipore&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">ESG1107&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11960-044&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DPBS (Dulbecco s phosphate buffer saline)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10829-018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Irradiated MEFs&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">S1520-100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">75-cm2 Tissue culture flasks&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">15-ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">50-ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Disposable surgical blades&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Disposable surgical blades&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Cryogenic vials&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">70 &#181;m Cell strainer&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10342-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell surface marker mediated purification of ips cell intermediates from a reprogrammable mouse model

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).

Après la dissection, la désagrégation et le placage d&#39;un embryon de souris E13.5, on prévoit une boîte de 10 cm à atteindre la confluence dans environ 1 à 2 jours. A ce stade, il est normal que la culture contient de quelques pièces de tissu adhérentes qui n&#39;ont pas été correctement cellularisées. Celles-ci disparaissent après repiquage. Lors de l&#39;induction de la doxycycline, les MEF reprogrammation subissent des changements morphologiques distincts. Autour jour 6, les premières plaques de colonies comme devraient commencer à apparaître (figure 4C). Ceux-ci vont continuer à croître en taille à autre culture (voir la figure 4D, E). Une bonne expérience de reprogrammation devrait aboutir à&gt; 500 colonies par T75 qui a été initialement ensemencé avec 5 x 10 5 cellules (figure 4E). Cultures iPS établies possèdent caractéristiques dôme en forme de colonies et doivent surtout être dépourvu de cellules différenciées (figure 4F). De temps en temps, des passages supplémentaires de iPS cultures peuvent être nécessaires pour éliminer les cellules indifférenciées / partiellement reprogrammées; un ballon confluente de cellules peut être divisée en un rapport de 01:10 sur une couche nourricière de MEF irradiés. Comme mentionné ci-dessus, les changements morphologiques et moléculaires au cours de reprogrammation se traduisent par des changements dans les profils FACS pour Thy-1.2, l&#39;AESS-1 et, finalement, EpCam (voir la figure 7A-F). Comme indiqué précédemment 12,15, tandis que MEF sont majoritairement positives pour Thy-1.2 et négatif pour les autres marqueurs, Jour 3 cultures ont déjà l&#39;air très différent. Une grande proportion de cellules ont commencé à réguler à la baisse l&#39;expression de Thy-1.2 et un très petit sous-ensemble de ces Thy-1.2 cellules négatifs sont devenus positifs pour l&#39;AESS-1, la reprogrammation réelle intermédiaire de ce point de temps. Le nombre d&#39;intermédiaires de reprogrammation qui peuvent être extraites de la Journée 3 cultures est très imprévisible que le pourcentage de l&#39;AESS-1 + / Thy-1.2-se trouve généralement dans une fourchette comprise entre 1-10% de viablcellules de e. Sur Jours 6 et 9 une augmentation du pourcentage de cellules AESS-1 +, bien au dessus de 10%, peut être détectée. Autour jour 12 un sous-ensemble de l&#39;AESS-1 cellules positives peut être détectée que étiqueter également positifs pour EpCam. Jour 12 cultures, comme Jour 3 cultures, représente un goulot d&#39;étranglement dans la purification des intermédiaires, comme le pourcentage de l&#39;AESS-1.2 + / EpCam + cellules est variable et se situe dans la gamme de seulement 2-4% de toutes les cellules vivantes en général. Le nombre attendu de reprogrammation des intermédiaires présentés dans le tableau 1 sert uniquement une approximation grossière. Cultures cellulaires établies de bonne foi iPS seront fortement positive pour l&#39;AESS-1 et EpCam. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: Surface des changements de position au cours de la voie de reprogrammation: régulation à la baisse de l&#39;identité des fibroblastes marqueur Thy-1.2 est suivi par une régulation deAESS-1. L&#39;transition d&#39;un sous-ensemble de l&#39;AESS 1-cellules positives vers un état ​​pluripotent est indiqué par l&#39;acquisition de EpCam autour du jour 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2: Représentation schématique du modèle de souris reprogrammable. Expression m2rtTA est sous le contrôle du locus Rosa26 ubiquitaire actif en présence de doxycycline (dox), la protéine m2rtTA se lie à un promoteur dépendant de tétracycline (tetOP) au collagène 1A1 (COL1A1) locus résultant dans l&#39;expression de la cassette à quatre facteurs. Deux cassettes bicistroniques sont liés par un site d&#39;entrée interne des ribosomes (IRES). Cadres de lecture ouverts pour Oct-4 / Klf-4 et Sox-2 / c-Myc sont fu<html> sed par F2A et E2A séquences d&#39;auto-clivage, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 embryons dissection: (A) transfert corne utérine dans un plat de 10 cm rempli de 10 ml de PBS et (B) coupé en morceaux contenant un embryon. (C) En utilisant des pinces libèrent les embryons à partir de tissu extra-embryonnaire et supprimer tête, les membres, la queue et les organes internes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> les / ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Patchs Figure 4 changements morphologiques au cours de reprogrammation. Colonies comme apparaissent dans les cultures du jour 6 partir. CSPi de bonne foi sont caractérisées par une morphologie en forme de dôme. (A) Jour 0 / MEF, (B) Jour 3, (C) Jour 6, (D) Jour 9, (E) Jour 12, (F) iPS culture cellulaire. Barre d&#39;échelle:. 200 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5 de configuration de base FACS. (A) Exclure les débris avec Side Scatter contre Forward Scatter zone blot. (B)Exclure les agrégats de débris non par le fenêtrage seule population cellulaire avec Forward Scatter zone contre Forward Scatter Haute blot. (C) Exclure les cellules mortes de la population d&#39;une seule cellule par le fenêtrage PI faibles des événements avec le canal de PI contre Forward Scatter zone blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig6highres.jpg" width="500" /> Figure 6 gate. (A, B) En utilisant les cellules de contrôle non étiquetés mis en place portes pour Thy-1.2 + / AESS-1-cellules, Tes 1.2--/ AESS-1-cellules et Thy-1.2-/ AESS-1 + cellules. (C) Utilisez les cellules témoins non marqués pour définir portes des cellules positifs et négatifs EpCam EpCam. (D) AESS-1 + / Tes-1.2- cellules peuvent être séparéesdans un EpCam positive et dans une population EpCam négatif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig7highres.jpg" width="500" /> Figure 7 Thy-1.2 par rapport à l&#39;AESS-1 FACS taches à différents stades du processus de reprogrammation. (A) Jour 0 / MEF, (B) Jour 3, (C) Jour 6, (D) Jour 9, (E) Jour 12, la culture cellulaire (F) iPS. Tableau 1 suggérés densité semis, le nombre de ballon et les résultats escomptés pour P1 MEF d&#39;un embryon hétérozygote pour OKSM et m2rtTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer h</a>avant de voir une version plus grande de cette figure. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Jour </td><td> Nombre de flacons T75 ensemencées au jour 0 </td><td> Nombre total de cellules SSEA1 + après FACS </td><td> Nombre total de SSEA1 + / EpCam + cellules après FACS </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 8 </td><td> 2 millions de </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 2 millions de </td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td> 4 </td><td> 2 millions de </td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 10 </td><td> 10 millions </td><td> 2 millions de </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model at JoVE.com

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.

Marqueur de surface cellulaire Purification médiation de iPS intermédiaires cellulaires à partir d&#39;un modèle reprogrammable souris

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...

cell-surface-marker-mediated-purification-ips-cell-intermediates-from

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K vues.  Monash University. Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam. 

Vidéo: Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Recherche

Biologie

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

L&#39;avidité d&#39;un dépistage interaction extracellulaire (AVEXIS) pour la détection évolutive de faible affinité extracellulaires interactions récepteur-ligand

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de HDAC

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

Visualisation et la Quantification du potentiel de différenciation des cellules mésenchymateuses adipocytaire avec un marqueur spécifique de la lignée

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Un modèle de souris d’une Obstruction intestinale partielle

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...