Cette nouvelle méthode efficace pour isoler les sous-populations de spermatocytes et de spermatods de souris adultes peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la méiose et à la spermatogenèse. Cette méthode utilise un colorant liant l’ADN à faible cytotoxicité avec un large spectre d’excitation qui peut être appliqué à la plupart des ordres FACS actuellement utilisés. Cette méthode est très simple.
L’aspect le plus difficile est la cytométrie du flux, mais la stratégie de gating détaillée devrait aider à adapter le protocole à d’autres trieurs de cellules. Yu-Han Yeh, assistant de recherche au laboratoire de Satoshi Namekawa, démontrera la procédure. Après avoir récolté les deux testicules d’une souris mâle de huit semaines, placez les tissus dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant deux millilitres de PBS glacé et retirez l’albuginea de tunica.
Séparer délicatement les testicules avec des forceps pour disperser légèrement les tubules séminifères. Et transférer les tubules dans une goutte de glace fraîche pbs froid dans une boîte de 100 millimètres Petri. Utilisez les forceps pour démêler doucement les tubules et laver les tubules dans trois gouttelettes supplémentaires de PBS comme nous venons de le démontrer.
Après le dernier lavage, placez les tubules séminifères non emmêlés dans un tube de 15 millilitres, contenant deux millilitres de tampon de dissociation pour une incubation de 20 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, utiliser une pipette de 1000 microlitres pour pipette doucement les tubules 20 fois, avant de retourner le tube à l’incubateur pendant six minutes supplémentaires. À la fin de l’incubation, pipette les tissus 20 fois supplémentaires, avant de retourner le tube à l’incubateur.
Après trois minutes, pipette doucement les tubules 10 fois ou jusqu’à ce qu’il ne reste pas de morceaux de tissu visibles, avant d’arrêter la dissociation avec 10 millilitres de tampon FACS. Ensuite, centrifugeuse à la suspension tissulaire deux fois en utilisant un supplément de 10 millilitres pour tampon FACS frais pour le deuxième lavage pour enlever le spermatozoa et autant de débris que possible. Pour tacher les cellules pour l’analyse cytométrique d’écoulement, re-suspendre la pastille en trois millilitres de tampon FACS.
Et filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire en nylon de 70 microns, dans un tube de 50 millilitres. Après dépouillement, transférer 10% des cellules dans un nouveau tube sur la glace comme le contrôle négatif non taché. Et bien mélanger six microlitres de tache DCV dans la suspension cellulaire restante.
Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité avec des secousses douces toutes les 10 minutes, ajouter cinq microlitres de DNase I aux cellules. Et filtrer les cellules à travers une passoire en maille de nylon de 35 microns dans un tube FACS de cinq millilitres sur la glace. Pour l’analyse cytométrique du flux des cellules, créez une nouvelle expérience dans le logiciel d’analyse de flux et, dans le menu des outils de la feuille de travail, cliquez sur une nouvelle densité pour créer une zone de dispersion vers l’avant par rapport à une parcelle de densité de zone de rétroédation à l’échelle linéaire.
Cliquez sur un nouvel histogramme pour créer une trace d’histogramme bleu DCV à l’échelle logarithmique. Et cliquez sur démarrer et enregistrer pour commencer à traiter l’échantillon non taché. Pendant que l’échantillon est en cours d’exécution, cliquez sur le détecteur et les paramètres de seuil pour ajuster les tensions PMT de dispersion avant et latérale pour placer les cellules non tachées sur l’échelle de la parcelle de dispersion avant et arrière.
Ajustez la tension de PMT pour le canal jappy pour localiser la position de la population négative de DCV dans la première décennie de la parcelle logarithmic bleue d’histogramme de DCV. Ensuite, cliquez sur arrêter pour décharger l’échantillon non taché. Après avoir brièvement tourbillonné et chargé l’échantillon taché, cliquez sur le tube suivant pour créer une nouvelle feuille de travail pour l’échantillon.
Réglez le cytomètre pour acquérir au moins une fois 10 pour les six événements, et cliquez sur démarrer et enregistrer. Ensuite, cliquez sur nouvelle densité pour créer la hauteur de dispersion vers l’avant par rapport à la largeur de dispersion avant. Et les parcelles de densité rouge DCV bleu contre DCV à l’échelle linéaire.
Sur la zone de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle de densité de la zone de rétrocâpeur, utilisez l’outil polygone pour dessiner une porte appelée cellules pour inclure la plupart des cellules et pour exclure les petits débris. Appliquez cette porte sur la hauteur de dispersion avant par rapport à la parcelle de largeur de dispersion avant et utilisez l’outil rectangle pour dessiner la porte d’une seule cellule pour exclure les cellules non simples. Appliquez la porte de la cellule unique sur la parcelle de densité rouge bleu DCV par rapport à la parcelle de densité rouge DCV et ajustez l’échelle pour capturer un profil étendu.
Utilisez l’outil polygone pour dessiner une porte DCV pour exclure les cellules non tachées et la population latérale, et appliquez la porte sur une parcelle d’histogramme bleu DCV à l’échelle linéaire. Les trois pics majeurs se réfèrent aux différents contenus d’ADN 1C, 2C et 4C. Créez une deuxième parcelle de densité rouge DCV bleue par rapport à la parcelle de densité rouge DCV sur une échelle linéaire.
Et porte arrière de la porte DCV sur la parcelle pour localiser les populations 1C et 4C. Créez une autre parcelle de densité rouge DCV bleue par rapport à la parcelle de densité rouge DCV sur une échelle linéaire. Et utilisez l’outil ellipse pour dessiner une porte sur la population 1C.
Utilisez l’outil polygone pour portailr la population de 4C avec une courbe continue. Et créez une autre parcelle de densité rouge DCV bleue par rapport à la DCV à l’échelle linéaire. Utilisez l’outil polygone pour créer une porte 4C one.
Dans une nouvelle parcelle de dispersion côte à côte, utilisez l’outil ellipse pour créer des portes pachytene, diplotène et leptotene, spermatocyte zygotène. Lorsque toutes les portes ont été dessinées, créez une nouvelle parcelle de point de couleur rouge DCV contre DCV sur une échelle linéaire pour appliquer la porte 4C pour s’assurer que les trois populations sont dans un ordre continu à l’intérieur de la porte. Ensuite, créez une nouvelle zone de dispersion vers l’avant par rapport à une parcelle de densité de zone de rétroscivité à l’échelle linéaire, et sélectionnez la taille unifiée des cellules comme une population de spermatozoïdes ronds purs.
Après le tri, les puretés représentatives des fractions séparées de spermatocyte de leptotene, de zygotène, de pachytene et de diplotène se situent généralement entre 80% et 90%, comme le confirment l’immunostaining SYCP3 et Gamma H2AX. La pureté de la faction ronde spermatid peut être confirmée par la coloration du noyau avec DCV en combinaison avec sp56 et h1t coloration, et est également généralement autour de 90%La viabilité des populations cellulaires isolées est généralement plus de 95%Et les rendements totaux moyens de chaque fraction d’une souris adulte unique est généralement suffisante pour diverses analyses en aval. Les cellules triées peuvent être utilisées pour diverses analyses de séquençage de prochaine génération afin de mieux explorer l’expression et la régulation des gènes pendant la spermatogenèse.
