Nous utilisons ce protocole pour fabriquer des cellules progénitrices neurales à partir de fibroblastes cutanés de patients et étudier les maladies neurologiques et neurodégénératives. Nous avons l’impression que ce protocole présente de nombreux avantages par rapport à la technologie IPS classique, y compris la vitesse, mais aussi l’obtention dans certains cas d’un phénotype de maladie plus grave. Nous étudions les maladies neurologiques et neurodégénératives et l’utilisation d’échantillons de peau nous permet vraiment d’évaluer la diversité des patients.
Mon laboratoire s’intéresse particulièrement au rôle des astrocytes dans les maladies et nous utilisons les astrocytes que nous faisons à partir des PNJ pour tester les médicaments et aussi pour étudier les mécanismes de la maladie, mais aussi dans les co-cultures avec des neurones humains et de souris. Nous espérons que ce protocole sera informatif et s’il vous plaît contactez-nous si vous avez des questions. Merci.
Utilisez des fibroblastes cutanés humains primaires qui peuvent être obtenus à partir de banques de cellules ou de biopsies cutanées. Cellules de culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire à 5% de CO2. Cellules de passage pour au moins un à deux passages après la décongélation avant utilisation dans l’expérience.
Une fois que les cellules sont prêtes, enrober un puits d’une plaque de six puits avec de la fibronectine humaine à une concentration de 1:200 diluée dans du PBS à température ambiante pendant 15 à 20 minutes. Préparer le média des fibroblastes comme indiqué dans le tableau un. Lorsque les cellules sont prêtes à être plaquées, retirez la fibronectine de la capsule et ajoutez immédiatement une solution cellulaire ou deux mils de milieux de fibroblastes.
Ne laissez pas le plat se dessécher avant d’ajouter du support. Selon la vitesse à laquelle les cellules se développent, plaque 150, 000 à 200, 000 fibroblastes dans deux puits d’une plaque humaine de six puits enduits de fibronectine. Cellules de culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire à 5% de CO2.
Le lendemain de l’ensemencement, vérifiez les fibroblastes au microscope et vérifiez que la densité cellulaire est comprise entre 70 et 85%Transducez un puits avec les quatre vecteurs rétroviraux: Oct3/4, Klf4, Sox2 et c-Myc. Utilisez une multiplicité d’infection de 10 pour les fibroblastes à croissance rapide ou de 15 pour les fibroblastes à croissance lente. L’efficacité de la transduction doit dépasser 70 % ou plus de cellules positives pour chaque vecteur.
Ajouter du milieu de fibroblaste régulier au mélange viral pour un volume total d’un mil par puits. Laissez le deuxième puits non traité et retournez les cellules à l’incubateur de culture tissulaire pour incuber pendant la nuit. Le lendemain de la transduction, laver les cellules une fois avec du PBS et ajouter un mil de milieux de fibroblastes frais.
Cellules de culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire à 5% de CO2. Le lendemain, préparez le milieu de conversion comme indiqué dans le tableau un et lavez les cellules une fois avec du PBS pour vous débarrasser du milieu fibroblaste résiduel, puis ajoutez un mil de milieu de conversion. Remplacez également le support du puits non traité par un support de conversion.
Observez les cellules au microscope et surveillez les changements de morphologie. Les milieux cellulaires doivent être remplacés quotidiennement tout au long du processus de conversion par un à deux mils de milieux de conversion et pour la culture iNPC subséquente. Modifiez le média en retirant soigneusement 70% du support du puits tout en vous assurant que les cellules restent couvertes dans les 30% restants du support.
Continuez à observer les cellules et changez de média quotidiennement avec un à deux mils de média de conversion. Après environ cinq à six jours dans les milieux de conversion ou lorsque les cellules deviennent très denses, les passer un à deux ou maximum un à trois. Réchauffer l’accutase et enduire un nombre approprié de puits dans une plaque de six puits avec une fibronectine totale d’un mil diluée 1:200 dans du PBS pendant 15 à 20 minutes à température ambiante.
Laver soigneusement les cellules avec du PBS sans détacher de cellules. Utilisez la paroi du puits pour appliquer doucement du PBS sur les cellules. Retirez soigneusement le PBS avec des pipettes ou en aspirant.
Ajouter 500 microlitres Accutase et incuber deux à trois minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire. Vérifiez au microscope que la plupart des cellules se sont détachées. Si les cellules se sont détacher, ajoutez deux mils de nouveaux milieux de conversion et pipettez doucement de haut en bas deux à trois fois pour dissocier les touffes.
Recueillir les cellules dans un tube de 15 mil et ajouter trois mils milieux pour diluer davantage l’Accutase. Centrifuger pendant quatre minutes à 200 G à température ambiante. Retirer le surnageant de la pastille cellulaire et ressusciter les cellules dans un mil de milieu frais.
Pipeter doucement de haut en bas deux à trois fois pour résoudre les touffes cellulaires. Retirez la fibronectine de six puits enduits et ajoutez immédiatement un mil de milieux frais à chaque puits. Pour un rapport de fractionnement de 1:2, ajouter 500 microlitres de la suspension cellulaire dans un puits et l’autre 500 dans un deuxième puits.
Distribuez les cellules en secouant doucement les six puits dans la direction nord-sud-est-ouest et mettez dans un incubateur de culture de tissus à 37 degrés. Observez les cellules au microscope le lendemain et changez de média avec un à deux mils. Changez de média tous les jours jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être fractionnées à nouveau.
Préparer les milieux NPC contenant du FGF à une concentration accrue sans EGF ni héparine, comme le voit le tableau un. Lors de cette nouvelle scission, ensemencez un puits de cellules dans un média de conversion et l’autre bien dans un média NPC. Continuez à changer de média d’iNPCs tous les jours avec un à deux mils de médias NPC.
Préparer les milieux astrocytaires selon le tableau un. Pour fabriquer des astrocytes à partir d’iNPCs frais, ensemencez des iNPCs directement dans 10 mils de milieux astrocytaires dans des plaques recouvertes de fibronectine de 10 centimètres afin qu’ils soient d’environ 10% de confluence le lendemain. Cellules de culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire à 5% de CO2.
Changer de milieu avec 10 mils de milieux astrocytes trois jours après le placage. Gardez les cellules différenciantes pendant cinq à sept jours. Pour ensemencer à des fins d’expérimentation, diviser les astrocytes à l’aide de trypsine ou d’accutase comme décrit aux étapes 2 à 2.6.
Les densités d’ensemencement recommandées sont incluses dans le tableau deux. Les instructions sur la façon de portion iNPCs pour générer des astrocytes induits se trouvent dans le tableau trois. Pour fabriquer des astrocytes à partir de stocks iNPC congelés, retirez une partie du dossier de stockage d’azote liquide et décongelez rapidement à 37 degrés Celsius.
Dès que les cellules sont décongelées, pipette solution cellulaire dans un tube de 15 mil contenant cinq mils de milieux astrocytaires. Centrifuger pendant quatre minutes à 200 G de température ambiante. Retirer le surnageant et le ressusciter dans un milieu astrocytaire frais mil.
Ajouter neuf mils de milieu d’astrocyte frais à un plat de 10 centimètres enduit de fibronectine et ajouter une solution de cellules mil, en distribuant doucement les cellules en mouvement nord-sud-est-ouest. Cellules de culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire à 5% de CO2. Ce protocole permet la génération rapide et facile d’iNPCs directement à partir des fibroblastes humains de peau utilisant des retrovirus contenant les facteurs yamanaka.
Cette méthode permet de contourner l’état des cellules souches et la nécessité d’une sélection clonale, évitant ainsi la variation clonale. Les étapes importantes à garder à l’esprit pendant que les cellules subissent le processus de conversion sont la densité d’ensemencement des fibroblastes, le pH du média et le maintien des cellules à une confluence optimale. Des exemples de changements optimaux de confluence et de morphologie au cours du processus de conversion peuvent être trouvés dans la figure un.
Une fois le processus de conversion terminé, les PNJ montreront une expression fortement réduite ou aucune expression des marqueurs et de la morphologie des fibroblastes et exprimeront des marqueurs cellulaires spécifiques au PNJ. En outre, ils peuvent également être utilisés pour générer différentes lignées cellulaires comme les neurones induits, oligodendrocytes, et les astrocytes. D’après notre expérience, les astrocytes induits en particulier sont très précieux pour l’essai de mécanisme de drogue et de maladie car ils peuvent être générés dans des populations pures à de grands nombres reproductibles.
Les astrocytes induits peuvent être différenciés des iNPCs en prenant une petite partie aliquote de cellules pendant la division ou une partie précédemment gelée d’iNPC et en plaquant directement dans des milieux astrocytaires. Les considérations importantes au cours de ce processus sont le maintien de la densité d’ensemencement initiale des iNPCs faible, car il a été démontré qu’une densité d’ensemencement élevée entrave le processus de différenciation, et l’attention supplémentaire accordée au pH du milieu, car l’acidification peut activer même des astrocytes sains. En résumé, le protocole de conversion directe est une méthode très rapide pour pouvoir fabriquer des cellules progénitrices neurales à partir d’échantillons de peau de patients.
Cela permet d’étudier un plus grand nombre d’échantillons de cellules en même temps et de vraiment regarder la diversité dans le contexte de la maladie. Nous pensons qu’il s’agit d’un test très puissant que vous pouvez utiliser pour fabriquer des cellules progénitrices neurales, des neurones, mais aussi des astrocytes qui peuvent ensuite être utilisés soit en co-culture, soit par eux-mêmes pour des tests de dépistage de drogues ou des études mécanistes.
