Cette méthode utilise la fluorescence pour déterminer si un transfert de protéine vers des liqidés biologiquement importants entre la membrane synthétique et contribue ainsi à la distribution de ces lipides à l’intérieur des cellules eucaryotes. Cette technique permet l’extraction et le transport d’un lipide naturel par une protéine, elle nécessite et des cellules de fluorescence et des liposomes qui sont faciles à fabriquer. Cette méthode peut être utilisée et modifiée pour obtenir un aperçu de la biologie cellulaire par les protéines derrière la distribution de certains lipides essentiels entre les organes et les membranes.
La démonstration visuelle est essentielle pour expliquer comment effectuer des mesures en temps réel du transfert lipidique par fluorescence. Maud Magdeleine, ingénieure pour mon laboratoire, fera également la démonstration de la procédure. Commencez par préparer un tampon d’acétate de potassium HEPES frais filtré et dégivré, complété par un chlorure de magnésium millimolaire pour former un tampon HKM.
Ensuite, préparez des liposomes uniquement en PC ou dopés en plus avec deux pour cent molaires PS ou PI(4)P. Maintenant, placez la fiole sur un évaporateur rotatif pour sécher le lipide sous vide. Dans un puits, mélanger des liposomes contenant deux pour cent molaires de PS avec un capteur lipidique, NBD-C2 Lact, à une concentration finale de 250 nanomolaires et un volume de 100 microlitres.
Remplissez un deuxième puits avec la même quantité de liposome et de lact NBD-C2 mélangé à trois protéines de transfert lipidiques micromolaires ou LTP. Remplissez un troisième puits avec 250 lactes nanomolaires NBD-C2 mélangées à des liposomes PC purs de 80 micromolaires et un quatrième puits avec des liposomes PC purs de 80 micromolaires. Répétez ces étapes pour préparer trois séries supplémentaires de quatre puits.
Placez ensuite la plaque multi-puits dans le lecteur de fluorescence. Pour chaque puits, enregistrez un spectre NBD de 505 à 650 nanomètres avec une bande passante de cinq nanomètres lors de l’excitation à 490 nanomètres à 25 degrés Celsius. Pour chaque série, soustrayez le spectre enregistré avec seulement des liposomes des autres spectres.
Pour le test d’extraction PI(4)P, préparez des liposomes dopés à deux pour cent molaires de phosphatidylinositol-4-phosphate et effectuez des mesures avec la sonde NBD-PH FAPP. Effectuez des expériences de contrôle et déterminez le pourcentage d’extraction. Après avoir fini d’extruder des liposomes, remplissez un tube avec ces liposomes extrudés.
Préparez un tampon HKM fraîchement dégazé et filtré et maintenez les tubes contenant des liposomes extrudés à température ambiante. Enveloppez les tubes contenant des liposomes avec de la phosphatidyléthanolamine étiquetée rhodamine dans du papier d’aluminium et stockez-les dans une boîte opaque pour éviter tout blanchiment photo. Réglez la température entre 25 et 37 degrés Celsius et ajustez les monochromemètres d’excitation à 460 nanomètres avec une bande passante courte de un à trois nanomètres et l’émission à 530 nanomètres avec une large bande passante supérieure à 10 nanomètres.
Réglez le temps d’acquisition sur vingt-cinq minutes avec une résolution temporelle d’au plus une seconde. Dans la cuvette de quartz, diluez 30 microlitres de la suspension de liposomes LA et de la solution mère de lact NBD-C2 et du tampon HKM pré-chaudr pour préparer un échantillon de 570 microlitres contenant 200 lipides totaux micromolaires et 250 lacts nanomolaires ou NBD-C2. Ajouter une petite barre d’agitation magnétique et positionner la cuvette dans le support du fluoromètre.
Une fois que l’échantillon est équilibré thermiquement, déclenchez la mesure. Après une minute, ajoutez 30 microlitres de la suspension de liposome LB à l’échantillon. Après trois minutes, injectez du LTP dans l’échantillon de sorte que la concentration finale du LTP soit de 200 nanomolaires, puis acquérez le signal pendant les 21 minutes restantes.
Effectuer une expérience parallèle pour normaliser le signal NBD. Mélanger 30 microlitres de suspension de liposomes d’équilibre LA avec 250 lacts nanomolaires NBD-C2 dans un tampon HKM à un volume final de 570 microlitres. Après une minute, injecter 30 microlitres de suspension de liposomes d’équilibre LB.
Convertir les courbes cinétiques mesurées avec un LTP d’intérêt pour déterminer la quantité de PS transférée de LA en liposomes LB au fil du temps. Normalisez ensuite chaque point de données de la courbe. Effectuez l’expérience PI(4)P en utilisant les mêmes paramètres et conditions d’émetteur au sol que pour le test de transfert PS.
Dans la cuvette, mélanger 30 microlitres de suspension de liposome lb et de sonde NBD-PH FAPP avec un tampon HKM préchauffé pour obtenir un volume final de 570 microlitres. Une fois l’équilibre thermique de l’échantillon atteint, commencez la mesure. Après une minute, injecter 30 microlitres de suspension de liposome LA.
Après trois minutes, injectez le LTP d’intérêt et enregistrez le signal. Effectuez une deuxième expérience pour normaliser le signal NBD. Mélanger 30 microlitres de suspension de liposomes d’équilibre lb avec 250 nanomolaires NBD-PH FAPP et 570 microlitres de tampon HKM.
Après une minute, injecter 30 microlitres de suspension de liposomes d’équilibre LA. Convertissez les courbes cinétiques pour déterminer la quantité de PI(4)P transférée des liposomes LB aux liposomes LA au fil du temps, puis normalisez chaque point de données. Quantifier la mesure dans laquelle un LTP est efficace.
Effectuer une régression linéaire des premiers points de données de la cinétique de transfert pour obtenir une pente. Divisez la valeur de pente par la concentration de LTP dans le mélange réactionnel pour déterminer le nombre de molécules lipidiques transférées par protéine et par unité de temps. La récupération efficace du lact C2 à partir des billes a été vérifiée avec l’analyse de la page SDS.
Le spectre absorbant visible ultraviolet de lacte C2 marqué avec NBD a confirmé que toutes les molécules de lactE C2 étaient étiquetées avec un groupe NBD. La pureté du lact NBD-C2 et sa fluorescence ont été déterminées par l’analyse de la page SDS. La fluorescence du lact NBD-C2 ou du FAPP NBD-PH était maximale lorsque seuls des liposomes contenant du PS ou du PI(4)P étaient utilisés pour l’incubation, ce qui indique que le capteur était lié à la membrane.
Une faible fluorescence a été observée lorsque Osh6p était également présent, indiquant que cette protéine extrayait efficacement PS ou PI(4)P des liposomes. Les résultats d’un test de transfert PS utilisant Osh6p comme LTP sont affichés. Les courbes cinétiques moyennes du transfert de PS des liposomes LA aux liposomes LB, dopés ou non dopés au phosphatidylinositol-4-phosphate ont été calculés.
Le taux de transport PS initial moyen a été déterminé à partir de trois expériences distinctes. De même, les résultats d’un test de transfert PI(4)P utilisant Osh6p comme LTP sont présentés ici. Avec les courbes cinétiques moyennes obtenues après normalisation du signal.
Les taux de transfert moyens ont été mesurés avec des liposomes LA qui ont été dopés ou non dopés avec PS. Lors de l’exécution de ce protocole, utilisez un nouveau tampon et préparez les mêmes jours. Minimisez l’exposition à la lumière des liposomes et des protéines florescents, utilisez des protéines étiquetées NBD bien purifiées et conservez-les sur la glace. peut être confirmé en mesurant le transfert de PS et de PI(4)P entre les organites à l’intérieur de la cellule procaryote à l’aide de capteurs lipidiques fluorescents génétiquement codés.
Cette technique ouvre la voie à une meilleure compréhension des PS et des PI(4) qui sont distribués au sein de la cellule, et leur activité subit la spécificité de plusieurs LTPS.
