Este método utiliza la fluorescencia para determinar si una proteína se transfiere a liqids biológicamente importantes entre la membrana sintética y así contribuir a la distribución de estos lípidos dentro de las células eucariotas. Esta técnica permite la extracción y transporte de un lípido natural por una proteína, requiere células de fluorescencia y liposomas que son fáciles de hacer. Este método se puede utilizar y modificar para obtener información sobre la biología celular mediante proteínas detrás de la distribución de algunos lípidos esenciales entre el órgano y las membranas.
La demostración visual es fundamental para explicar cómo realizar mediciones en tiempo real de la transferencia de lípidos por fluorescencia. Así que demostrando el procedimiento también estará Maud Magdeleine, una ingeniera de mi laboratorio. Comience preparando un tampón de acetato de potasio HEPES fresco filtrado y des gaseado, complementado con un cloruro de magnesio milimolar para formar un tampón HKM.
Luego, prepare liposomas solo hechos de PC o dopados adicionalmente con dos porcentajes molares PS o PI(4)P. Ahora, coloque el matraz en un evaporador rotativo para secar el lípido al vacío. En un pozo, mezcle liposomas que contengan dos porcentajes molares de PS con sensor de lípidos, NBD-C2 Lact, a una concentración final de 250 nanomolares y un volumen de 100 microlitros.
Llene un segundo pozo con la misma cantidad de liposoma y lacta NBD-C2 mezclado con tres proteínas de transferencia de lípidos micromolares o LTP. Llene un tercer pozo con 250 lact nanomolares NBD-C2 mezclados con liposomas PC micromolares puros de 80 y un cuarto pozo con liposomas PC micromolares puros de 80. Repita estos pasos para preparar tres series adicionales de cuatro pozos.
Luego coloque la placa de múltiples pozos en el lector de fluorescencia. Para cada pozo registre un espectro NBD de 505 a 650 nanómetros con un ancho de banda de cinco nanómetros tras la excitación a 490 nanómetros a 25 grados centígrados. Para cada serie, reste el espectro registrado con solo liposomas de los otros espectros.
Para el ensayo de extracción PI(4)P preparar liposomas dopados con dos porcentajes molares de fosfatidilinositol-4-fosfato y realizar mediciones con la sonda NBD-PH FAPP. Realice experimentos de control y determine el porcentaje de extracción. Después de terminar de extruir los liposomas llenan un tubo con estos liposomas extruidos.
Prepare un tampón HKM recién des gaseado y filtrado y mantenga los tubos que contienen liposomas extruidos a temperatura ambiente. Envuelva los tubos que contienen liposomas con fosfatidiletanolamina etiquetada con rodamina en papel de aluminio y guárdelos en una caja opaca para evitar cualquier fotoblanqueo. Ajuste la temperatura entre 25 y 37 grados centígrados y ajuste los monocromómetros de excitación a 460 nanómetros con un ancho de banda corto de uno a tres nanómetros y la emisión a 530 nanómetros con un gran ancho de banda de más de 10 nanómetros.
Establezca el tiempo de adquisición en veinticinco minutos con la resolución de tiempo de como máximo un segundo. En la cubeta de cuarzo diluir 30 microlitros de la suspensión de liposomas LA y la solución madre de lact NBD-C2 y el tampón HKM precalentado para preparar una muestra de 570 microlitros que contiene 200 lípidos totales micromolares y 250 nanomolares o NBD-C2 lact. Agregue una pequeña barra de agitación magnética y coloque la cubeta en el soporte del fluorómetro.
Una vez que la muestra está equilibrada térmicamente, se activa la medición. Después de un minuto, agregue 30 microlitros de la suspensión de liposomas LB a la muestra. Después de tres minutos, inyecte LTP en la muestra para que la concentración final de LTP sea de 200 nanomolares, luego adquiera la señal durante los 21 minutos restantes.
Realizar un experimento paralelo para normalizar la señal NBD. Mezclar 30 microlitros de suspensión de liposomas de equilibrio LA con 250 lact nanomolares NBD-C2 en tampón HKM a un volumen final de 570 microlitros. Después de un minuto, inyecte 30 microlitros de suspensión de liposomas de equilibrio LB.
Convierta las curvas cinéticas medidas con un LTP de interés para determinar la cantidad de PS transferido de LA a liposomas LB a lo largo del tiempo. A continuación, normalice cada punto de datos de la curva. Realice el experimento PI(4)P utilizando los mismos ajustes y condiciones del emisor de suelo que para el ensayo de transferencia PS.
En la cubeta, mezcle 30 microlitros de suspensión de liposomas lb y sonda NBD-PH FAPP con tampón HKM precalentado para obtener un volumen final de 570 microlitros. Una vez alcanzado el equilibrio térmico de la muestra, iniciar la medición. Después de un minuto, inyecte 30 microlitros de suspensión de liposomas LA.
Después de tres minutos, inyecte el LTP de interés y grabe la señal. Realice un segundo experimento para normalizar la señal NBD. Mezcle 30 microlitros de suspensión de liposomas de equilibrio lb con 250 nanomolares NBD-PH FAPP y 570 microlitros de tampón HKM.
Después de un minuto, inyecte 30 microlitros de suspensión de liposomas de equilibrio LA. Convierta las curvas cinéticas para determinar la cantidad de PI(4)P transferido de LB a liposomas LA a lo largo del tiempo, luego normalice cada punto de datos. Cuantificar el grado en que un LTP es eficiente.
Realizar una regresión lineal de los primeros puntos de datos de la cinética de transferencia para obtener una pendiente. Divida el valor de pendiente por la concentración de LTP en la mezcla de reacción para determinar el número de moléculas lipídicas transferidas por proteína por unidad de tiempo. La recuperación eficiente de la lactancia C2 de las cuentas se verificó con el análisis de la página SDS.
El espectro absorbente ultravioleta visible de C2 lact etiquetado con NBD confirmó que todas las moléculas de C2 lact fueron etiquetadas con un grupo NBD. La pureza del lacto NBD-C2 y su fluorescencia se determinaron mediante el análisis de páginas SDS. La fluorescencia de NBD-C2 lact o NBD-PH FAPP fue máxima cuando solo se utilizaron liposomas que contenían PS o PI(4)P para la incubación, lo que indica que el sensor estaba unido a la membrana.
Se observó una baja fluorescencia cuando Osh6p también estaba presente, lo que indica que esta proteína extrajo eficientemente PS o PI(4)P de los liposomas. Se muestran los resultados de un ensayo de transferencia de PS utilizando Osh6p como LTP. Se calcularon las curvas cinéticas promedio de transferencia de PS de liposomas LA a liposomas LB, dopados o no dopados con fosfatidilinositol-4-fosfato.
La tasa media inicial de transporte de PS se determinó a partir de tres experimentos distintos. Del mismo modo, los resultados de un ensayo de transferencia PI(4)P utilizando Osh6p como LTP se muestran aquí. Junto con las curvas cinéticas medias obtenidas tras la normalización de la señal.
Las tasas medias de transferencia se midieron con liposomas de LA dopados o no dopados con PS. Al realizar este protocolo utilice un búfer nuevo y prepárese los mismos días. Minimice la exposición a la luz de liposomas y proteínas fluorescentes, use proteínas bien purificadas con la etiqueta NBD y manténgalas en hielo. se puede confirmar midiendo la transferencia de PS y PI(4)P entre orgánulos dentro de la célula procariota utilizando sensores de lípidos fluorescentes codificados genéticamente.
Esta técnica allana el camino para una mejor comprensión de PS y PI(4) se distribuyen dentro de la célula, y su actividad sufre la especificidad de varios LTPS.
