Questo metodo utilizza la fluorescenza per determinare se una proteina si trasferisce a liqidi biologicamente importanti tra membrana sintetica e quindi contribuisce alla distribuzione di questi lipidi all'interno delle cellule eucariotiche. Questa tecnica permette l'estrazione e il trasporto di un lipide naturale da parte di una proteina, richiede e fluorescenza di cellule e liposomi che sono facili da realizzare. Questo metodo può essere utilizzato e modificato per ottenere informazioni sulla biologia cellulare dalle proteine dietro la distribuzione di alcuni lipidi essenziali tra organo e membrane.
La dimostrazione visiva è fondamentale per spiegare come eseguire misurazioni in tempo reale del trasferimento lipidico per fluorescenza. Quindi a dimostrare la procedura sarà anche Maud Magdeleine, un ingegnere per il mio laboratorio. Inizia preparando un tampone di acetato di potassio HEPES fresco filtrato e degassato, integrato con un cloruro di magnesio millimolare per formare un tampone HKM.
Quindi, preparare i liposomi fatti solo di PC o ulteriormente drogati con il due percento molare PS o PI (4) P. Ora, posiziona il pallone su un evaporatore rotante per asciugare il lipide sotto vuoto. In un pozzo, mescolare liposomi contenenti due percentuali molari di PS con sensore lipidico, NBD-C2 Lact, fino a una concentrazione finale di 250 nanomolari e un volume di 100 microlitri.
Riempire un secondo pozzo con la stessa quantità di liposoma e latto NBD-C2 miscelato con tre proteine di trasferimento lipidico micromolari o LTP. Riempi un terzo pozzo con 250 latto NBD-C2 nanomolari mescolato con 80 liposomi PC micromolari puri e un quarto pozzo con liposomi PC micromolari puri 80. Ripetere questi passaggi per preparare tre serie aggiuntive di quattro pozzi.
Quindi posizionare la piastra multi-pozzo nel lettore di fluorescenza. Per ogni pozzo registrare uno spettro NBD da 505 a 650 nanometri con una larghezza di banda di cinque nanometri all'eccitazione a 490 nanometri a 25 gradi Celsius. Per ogni serie sottrarre lo spettro registrato con i soli liposomi dagli altri spettri.
Per il test di estrazione PI(4)P preparare liposomi drogati con fosfatidilinositolo-4-fosfato a due percentuali molari ed effettuare misurazioni con la sonda NBD-PH FAPP. Eseguire esperimenti di controllo e determinare la percentuale di estrazione. Dopo aver finito di estrudere i liposomi riempire un tubo Con questi liposomi estrusi.
Preparare il tampone HKM appena degassato e filtrato e mantenere i tubi contenenti liposomi estrusi a temperatura ambiente. Avvolgere i tubi contenenti liposomi con rodamina etichettata fosfatidiletanolammina in un foglio di alluminio e conservarli in una scatola opaca per evitare qualsiasi sbiancamento fotografico. Impostare la temperatura tra 25 e 37 gradi Celsius e regolare i monocromatici di eccitazione a 460 nanometri con una breve larghezza di banda da uno a tre nanometri e l'emissione a 530 nanometri con una grande larghezza di banda superiore a 10 nanometri.
Imposta il tempo di acquisizione su venticinque minuti con la risoluzione del tempo di al massimo un secondo. Nella cuvetta di quarzo diluire 30 microlitri della sospensione liposomica LA e nbd-C2 lact stock solution e tampone HKM prebellico per preparare un campione di 570 microlitri che contiene 200 lipidi totali micromolari e 250 nanomolari o NBD-C2 lact. Aggiungere una piccola barra di agitazione magnetica e posizionare la cuvetta nel porta fluorometro.
Una volta che il campione è bilanciato termicamente, attivare la misurazione. Dopo un minuto, aggiungere 30 microlitri della sospensione di liposomi LB al campione. Dopo tre minuti iniettare LTP nel campione in modo che la concentrazione finale dell'LTP sia di 200 nanomolari, quindi acquisire il segnale per i restanti 21 minuti.
Effettuare un esperimento parallelo per normalizzare il segnale NBD. Mescolare 30 microlitri di sospensione liposomico di equilibrio LA con 250 nanomolari NBD-C2 lact in tampone HKM ad un volume finale di 570 microlitri. Dopo un minuto, iniettare 30 microlitri di sospensione di liposomi di equilibrio LB.
Convertire le curve cinetiche misurate con un LTP di interesse per determinare la quantità di PS trasferita dai liposomi LA a LB nel tempo. Quindi normalizzare ogni punto dati della curva. Eseguire l'esperimento PI(4)P utilizzando le stesse impostazioni e condizioni dell'emettitore a pavimento del test di trasferimento PS.
Nella cuvetta, mescolare 30 microlitri di sospensione di liposomi lb e sonda NBD-PH FAPP con tampone HKM preriscaldato per ottenere un volume finale di 570 microlitri. Una volta raggiunto l'equilibrio termico del campione, avviare la misurazione. Dopo un minuto, iniettare 30 microlitri di sospensione di liposomi LA.
Dopo tre minuti, iniettare l'LTP di interesse e registrare il segnale. Eseguire un secondo esperimento per normalizzare il segnale NBD. Mescolare 30 microlitri di sospensione liposomico di equilibrio lb con 250 nanomolari NBD-PH FAPP e 570 microlitri di tampone HKM.
Dopo un minuto, iniettare 30 microlitri di sospensione di liposomi di equilibrio LA. Convertire le curve cinetiche per determinare la quantità di PI(4)P trasferita dai liposomi LB a LA nel tempo, quindi normalizzare ogni punto dati. Quantificare la misura in cui un LTP è efficiente.
Eseguire una regressione lineare dei primi punti dati della cinetica di trasferimento per ottenere una pendenza. Dividere il valore di pendenza per la concentrazione di LTP nella miscela di reazione per determinare il numero di molecole lipidiche trasferite per proteina per unità di tempo. Il recupero efficiente del latto C2 dalle pere è stato verificato con l'analisi della pagina SDS.
Lo spettro assorbente visibile ultravioletto del latto C2 etichettato con NBD ha confermato che tutte le molecole di latto C2 sono state etichettate con un gruppo NBD. La purezza del latto NBD-C2 e la sua fluorescenza sono state determinate dall'analisi della pagina SDS. La fluorescenza del latto NBD-C2 o NBD-PH FAPP era massima quando solo i liposomi contenenti PS o PI(4)P venivano utilizzati per l'incubazione, indicando che il sensore era legato alla membrana.
Una bassa fluorescenza è stata osservata quando Osh6p era presente anche indicando che questa proteina estraeva in modo efficiente PS o PI(4)P dai liposomi. Vengono mostrati i risultati di un test di trasferimento PS che utilizza Osh6p come LTP. Sono state calcolate le curve cinetiche medie del trasferimento di PS dai liposomi LA ai liposomi LB, drogati o non drogati con fosfatidilinositolo-4-fosfato.
La velocità media iniziale di trasporto ps è stata determinata da tre esperimenti distinti. Allo stesso modo, i risultati di un test di trasferimento PI(4)P che utilizza Osh6p come LTP sono mostrati qui. Insieme alle curve cinetiche medie ottenute dopo la normalizzazione del segnale.
Le velocità di trasferimento medio sono state misurate con liposomi LA che sono stati drogati o non drogati con PS. Quando si esegue questo protocollo, utilizzare un buffer fresco e preparare gli stessi giorni. Ridurre al minimo l'esposizione leggera di liposomi e proteine fluorescenti, utilizzare proteine etichettate NBD ben purificate e tenerle sul ghiaccio. può essere confermato misurando il trasferimento di PS e PI(4)P tra organelli all'interno della cellula procariotica utilizzando sensori lipidici fluorescenti geneticamente codificati.
Questa tecnica apre la strada a una migliore comprensione di PS e PI(4) sono distribuiti all'interno della cellula e la loro attività subisce la specificità di diversi LTPS.
