Ce travail est soutenu par le projet financé par le KAIST K-Vallée Rouge &amp; B pour 2014 et le programme de recherche en sciences de base par la National Research Foundation de Corée (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

Attention: Reportez-vous aux fiches de données de sécurité (FDS) avant l&#39;utilisation de l&#39;acétone et le chloroforme qui sont cancérigènes. 1. Préparation de phospholipides monocouche à une interface air-eau plat <ol><li> Formation d&#39;une monocouche de phospholipides <ol><li> Préparation d&#39;une solution de phospholipide <ol><li> Nettoyer un flacon de 4 ml avec un bouchon de polytétrafluoroéthylène revêtu avec de l&#39;acétone, de l&#39;éthanol et de l&#39;eau déminéralisée au moins trois fois, et souffler à fond de l&#39;azote gazeux dans le flacon de se débarrasser de l&#39;eau. </li><li> Dissoudre 1 mg de phospholipides (par exemple, la dioléoylphosphatidylcholine, DOPC) à 1 ml de chloroforme dans le flacon pour obtenir 1 mg / ml de concentration. Effectuez cette procédure dans une hotte de sécurité. Utiliser des concentrations inférieures ou supérieures d&#39;une solution de phospholipide, si nécessaire. </li><li> Ajouter colorant phospholipides marqués (par exemple, la rhodamine dipalmitoylphosphatidyléthanolamine, la rhodamine DPPE) avec moins de 1% en moles de phospholipide de la solution, afin de visualiser la monocouche de phospholipide avec un microscope à fluorescence. Effectuez cette procédure dans une hotte de sécurité. </li><li> Envelopper le flacon avec un ruban de polytétrafluoroéthylène pour empêcher l&#39;évaporation du solvant, et de stocker l&#39;échantillon dans un congélateur à -20 ° C. </li></ol></li><li> Dépôt de phospholipides sur l&#39;interface air-eau <ol><li> Nettoyer une boîte de Petri (55 mm de diamètre et 12 mm de hauteur) avec de l&#39;éthanol et de l&#39;eau désionisée au moins trois fois. </li><li> Remplissez la boîte de Petri avec 10 ml d&#39;eau déminéralisée pour créer une interface air-eau. </li><li> Étaler quelques microlitres de la solution de phospholipides avec une micro-seringue sur une interface propre pour obtenir la pression de surface souhaitée et attendez au moins 30 minutes pour évaporer le solvant complètement, avant de faire l&#39;expérience. Remarque: Une cuvette de Langmuir peut être utilisé à la place d&#39;une boîte de Pétri si le contrôle précis de la pression de surface est nécessaire. </li></ol></li></ol></li><li> Sumesure de la pression rface <ol><li> Mesurer la pression de surface de la monocouche de phospholipide avec un tensiomètre à plaque de Wilhelmy. Attendez au moins 30 minutes pour obtenir le papier filtre mouillé suffisant si papier filtre est utilisé comme une plaque Wilhelmy. Le protocole détaillé est disponible dans Kuhn et al. 20. </li><li> Ajuster la quantité déposée du phospholipide pour réguler la pression de surface de précision. Ajouter 4 ul de la solution de DOPC (1 mg / ml) sur la -zone 30,25 cm 2 de l&#39;interface si ~ 5 mN / m de surface de pression est nécessaire. Remarque: Si le papier filtre est pas complètement mouillée, la pression de surface change radicalement au cours des 30 premières minutes de l&#39;expérience en raison du changement de poids du papier filtre. </li></ol></li><li> Minimisation de l&#39;écoulement convectif de la monocouche <ol><li> Utilisation d&#39;un appareil en forme de cône qui contient un réservoir de 3 mm avec deux canaux minces, connecté à une grande partie de la boîte de Petri, afin de supprimer le flux convectif dela monocouche, ce qui peut perturber la morphologie de l&#39;imagerie et de mesure de pression de surface. </li><li> Veillez à faire correspondre les niveaux d&#39;eau entre l&#39;intérieur et l&#39;extérieur de l&#39;appareil en forme de cône pour assurer que les phospholipides se déplacer librement sur l&#39;ensemble de la région avant de déposer phospholipides sur l&#39;interface air-eau. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de phospholipides monocouche à la surface courbe d&#39;un Droplet <ol><li> Resserré processus d&#39;un capillaire de verre en utilisant micropipette extracteur <ol><li> Placer un capillaire en verre (1 od mm, 0,78 mm ID, longueur 100 mm) sur un support de capillaire d&#39;un extracteur micropipette. </li><li> Concevoir un programme pour tirer les capillaires avec des valeurs de paramètres appropriées (Heat: Rampe, Pull: 60, Vel: 70, Delay: 70 et 200 Pression) et tirez les capillaires avec le programme conçu selon le protocole du fabricant. Remarque: un capillaire fin avec un diamètre de quelques micromètres, est nécessaire pour former une gouttelette de 100 pm d&#39;appl parying une pression avec ~ 10 kPa. Si l&#39;extrémité du capillaire de la pointe est trop petit, la pression beaucoup plus élevé,&gt; 600 kPa, est nécessaire pour obtenir la goutte, alors qu&#39;il est difficile de contrôler la taille des gouttelettes avec un trop grand extrémité de pointe capillaire. </li></ol></li><li> Absorption des phospholipides sur la surface de la gouttelette Remarque: Pour former une monocouche de phospholipides à l&#39;interface courbée d&#39;une goutte, une solution de phospholipide marqué sans colorant phospholipides est utilisé pour obtenir un contraste d&#39;intensité, contre la monocouche plat, préparé selon la procédure 1. En outre, les deux procédures 2.2.1 et 2.2 .2 sont ici permise. Si un contrôle précis de la pression de surface à la surface des gouttelettes est nécessaire, la procédure 2.2.2 est fortement recommandé. Cependant, dans la négative, la procédure 2.2.1, ce qui est une manière beaucoup plus facile que la procédure 2.2.2, est utile. <ol><li> Processus de phospholipides revêtement à une extrémité pointe <ol><li> Nettoyer une lame de verre avec de l&#39;acétone, de l&#39;éthanol et de l&#39;eau déminéralisée au moins trois fois. </li><li> Place capillaire conique sur une lame de verre nettoyée, et inclinez le capillaire pour faciliter toucher le verre coulissant avec une extrémité de pointe. </li><li> Déposez quelques gouttes de solution de phospholipides (1 mg / ml) sur l&#39;extrémité d&#39;un capillaire qui est collée à la lame de verre à l&#39;aide d&#39;une seringue de verre de pointe, et attendre au moins 30 minutes pour évaporer le solvant complètement. Remarque: Il est fortement recommandé de respecter l&#39;extrémité du capillaire à la lame de verre de pointe durant la procédure 2.2.1.3 parce que le périmètre de l&#39;extrémité de la pointe est trop petit pour contenir la goutte des phospholipides à l&#39;extrémité de pointe que par la force capillaire. </li></ol></li><li> Préparation d&#39;une solution de vésicules <ol><li> Nettoyer un flacon, et éliminer l&#39;eau du flacon, comme présenté dans la procédure 1.1.1.1. </li><li> Sécher le volume 2 de un ml de la solution de phospholipide (1 mg / ml) en appliquant doucement de l&#39;azote gazeux, et dessécher la fiole pendant 1 heure à température ambiante pour éliminer tout solvant restant. Effectuez cette procédure dans une hotte de sécurité. </li><li> Ajouter 2ml d&#39;eau désionisée dans le flacon contenant les lipides séché, et incuber le flacon dans une étuve à 60 ° C pendant 1 heure. </li><li> Agiter le flacon à plusieurs reprises, et soniquer (HF-fréquence: jusqu&#39;à 40 kHz, Puissance: 370 W) pendant 30 min pour obtenir des vésicules. </li><li> Effectuer les procédés d&#39;extrusion et de gel-dégel à obtenir des vésicules unilamellaires monodisperses. Le protocole détaillé pour la préparation des vésicules est décrite dans Mayer et al., 21. Remarque: la pression de surface de l&#39;interface des gouttelettes est commandé en ajustant avec précision le temps d&#39;attente après la formation de la gouttelette qui contient des vésicules unilamellaires monodisperses. Utilisation d&#39;une méthode de la goutte pendante 22, il est nécessaire de mesurer la variation de la pression de surface en fonction du temps, avant de faire l&#39;expérience. </li></ol></li></ol></li><li> La formation d&#39;une gouttelette contenant une monocouche de phospholipides à la surface courbe <ol><li> Remplissez le capillaire conique avec 10 pi d&#39;eau déminéralisée de procedure 2.2.1. Vous pouvez également utiliser 10 pi de la solution de la vésicule de la procédure 2.2.2. </li><li> Connecter le capillaire à un micro-injecteur automatique pour fournir la pression pour former la goutte. </li><li> Monter le capillaire qui est connecté à un micro-injecteur à un micromanipulateur pour commander la position du capillaire avec précision. </li><li> Préparer un microscope à champ lumineux (Microscope 1, objectif: 10X NA 0,3) pour l&#39;imagerie de la vue latérale du capillaire avec une caméra CCD. Microscope 1 permet ainsi d&#39;observer la position exacte de la goutte le long de l&#39;axe z et estimer la taille de la gouttelette. </li><li> Déplacer l&#39;extrémité de pointe à une position où la vue latérale de l&#39;extrémité de pointe est bien visualisé par Microscope 1 en utilisant un micromanipulateur, et appliquer une pression variable (~ 100 hPa) avec l&#39;extrémité du capillaire de pointe, jusqu&#39;à une taille appropriée (~ 100 um de diamètre) de gouttelette est formée. Remarque: Il est recommandé que les micro-injecteur et micromanipulateur automatisé être utiliséd, si le contrôle précis de la taille des gouttelettes et de l&#39;emplacement de la goutte est nécessaire. Il est également possible d&#39;utiliser les manuels. </li></ol></li></ol> 3. Imaging Fluorescence Recovery après la fusion des gouttelettes Remarque: Les principes fondamentaux de ce protocole sont identiques à ceux de la technique de FRAP, sauf pour le processus de coalescence des gouttes. Les théories de protocole et connexes détaillées de FRAP sont disponibles dans A. Lopez et al. 15 et D. Axelrod et al. 16. <ol><li> Surveiller et contrôler l&#39;emplacement de la gouttelette <ol><li> Préparer un microscope inversé set (Microscope 2, objectif: 10X NA 0,3, lentille de tube: longueur focale de 17 cm) qui permet à la fois un microscope à fluorescence avec un ensemble de filtre approprié pour la rhodamine DPPES (excitation à 560 nm, émission à 583 nm) et un microscope à champ lumineux. Utiliser une caméra CCD ici pour visualiser les vues de dessus de la gouttelette avec un microscope à fluorescence mode et un mode de microscope à champ lumineux. </li><li> Déplacer la goutte revêtu d&#39;un phospholipide à une interface air-eau à plat le long de l&#39;axe z, mais ne pas fusionner les gouttelettes encore à l&#39;aide du micromanipulateur. Utiliser une Microscope à visualiser la vue latérale de la gouttelette. </li><li> Localisez la goutte au centre de la vue de dessus de la monocouche plat, en utilisant le micromanipulateur. Utilisez le mode de microscope à champ clair de Microscope 2 pour visualiser vue de dessus de monocouche plat. </li></ol></li><li> La fusion de la goutte sur l&#39;interface air-eau plate <ol><li> Déplacez la gouttelette de plus vers l&#39;interface plat jusqu&#39;à la goutte fusionne sur l&#39;interface, en utilisant le micromanipulateur. Si le processus de fusion est réalisé avec succès, une zone sombre avec une forme circulaire qui est entouré par un fond blanc, est observé en utilisant le mode de microscope de fluorescence 2. </li><li> Enregistrer la série d&#39;images à fluorescence en fonction du temps après la fusion de la goutte, l&#39;aide du mode de fluorescence de Microsfaire face 2. Utilisez un taux de trame plus rapide que l&#39;échelle de temps de diffusion de la monocouche ici. Dans DOPC monocouche, il faut quelques minutes pour diffuser dans la zone 200 um sombre complètement. </li></ol></li></ol> 4. Détermination du coefficient de diffusion par analyse d&#39;image Remarque: Pour déterminer le coefficient de diffusion à partir d&#39;une série d&#39;images, le programme sur mesure pour l&#39;analyse d&#39;image est construit comme décrit ci-dessous. Un code source détaillée de ce programme est disponible sur le site JoVE. <ol><li> La détection d&#39;une région d&#39;intérêt circulaire <ol><li> La détection du centre de la région d&#39;intérêt <ol><li> Obtenir une série d&#39;images fluorescentes qui ont été enregistrées au cours d&#39;un processus de récupération qui contient une zone sombre circulaire et un fond blanc, et définir la première image de la série comme une image de référence. Ici, R D est le rayon de la zone sombre dans une image de référence. </li><li> Convolute l&#39;image de référence avec un cercle blanc quiintensité soi est uniforme sur toute une région. Utilisez la fonction intégrée nommé &#39;conv2 »pour convolution comme indiqué dans le code source de la ligne de programme personnalisé 124. Ici, le rayon du cercle blanc est légèrement plus petit que R D. </li><li> Trouver une position qui indique une valeur minimale dans le calcul de la convolution, et définir cette position en tant que centre de la région d&#39;intérêt dans l&#39;image de référence. </li></ol></li><li> La détermination d&#39;un rayon de la région d&#39;intérêt <ol><li> Convolute l&#39;image de référence avec un cercle blanc qui contient une position de centre, déterminé par une procédure 4.1 et l&#39;intensité uniforme sur toute une région. Ici, R S est le rayon du cercle blanc. Utilisez itération comme «pour» ou «tout» à l&#39;équation d&#39;un cercle pour faire le cercle blanc comme indiqué dans le code source de la ligne de programme personnalisé 102 à 109. </li><li> Convolute l&#39;image de référence avec un autre cercle blanc qui a un peuplus grand rayon (5% -10%), R L, R que S. Utilisez la même méthode avec la procédure 4.1.2.1 pour faire le cercle comme indiqué dans le code source de la ligne de programme personnalisé 113-120. </li><li> Obtenir la différence de valeur entre les deux calculs de convolution de 4.1.2.1 et 4.1.2.2. </li><li> Répéter les procédures ci-dessus de R S R = D / 2 à R S = 2R D, en augmentant à la fois la S R R L et à un niveau de pixel. Faire une itération qui contient les codes sources entières de procédure 4.1.2.1 à 4.1.2.3 de répéter. </li><li> Trouver le rayon R S indique que la différence maximum de valeur entre les deux calculs de convolution. Utilisez la fonction intégrée nommée &#39;max&#39; pour trouver le rayon indique la différence maximale de la valeur comme indiqué dans le code source de la ligne de programme personnalisé de 148 à 149. Cette R S indique ainsi le rayon de la zone sombre dans l&#39;image de référence. </li></ol></li&gt; </ol></li><li> Calcul d&#39;une intensité fractionnaire <ol><li> Définir un cercle qui contient une position de centre et un rayon, déterminé par une procédure 4,1 comme région d&#39;intérêt. </li><li> Calculer les intensités moyennes de la région d&#39;intérêt dans une série d&#39;images de fluorescence en fonction du temps. Convolute chaque cadre avec la région d&#39;intérêt et le diviser par domaine de la région d&#39;intérêt pour calculer l&#39;intensité moyenne. Les détails sont disponibles dans le code source du programme sur mesure qui est disponible sur le site JoVE. </li><li> Calculer une intensité fractionnaire, définie par l&#39;équation ci-dessous, où F (t) est l&#39;intensité moyenne dans le cercle qui est une région d&#39;intérêt en fonction du temps, F i est l&#39;intensité initiale dans le cercle, et F o est l&#39;intensité du un fond blanc. f (t) = (F (t) - F i) / (F o - F i) (équation 1). </li></ol></li><li> Montage de la fintensité ractional à la théorie de FRAP <ol><li> Monter l&#39;intensité fractionnée avec l&#39;équation ci-dessous, où τ est un temps caractéristique de diffusion et I 0, I 1 sont modifiés fonctions de Bessel, en utilisant un programme d&#39;ajustement, et d&#39;obtenir τ <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> (Equation 2). </li><li> Obtenir un coefficient de diffusion sur la base de la relation, τ = 2/4 D, où D est le coefficient de diffusion et a est le rayon de la zone sombre. Remarque: Pendant le processus d&#39;ajustement, il est possible de changer le profil d&#39;intensité fractionnée le long d&#39;un axe de temps lorsque le processus de récupération a déjà commencé, avant d&#39;enregistrer les images. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids:+where+they+are+and+how+they+behave.">Membrane lipids: where they are and how they behave.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).</li><li>Christon, R., Even, V., Daveloose, D., L&#233;ger, C. L., Viret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+fluidity+and+lipid&#8212;protein+relationships+in+pig+intestinal+brush-border+membrane+by+dietary+essential+fatty+acid+deficiency.">Modification of fluidity and lipid&#8212;protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).</li><li>Stubbs, C. D., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modification+of+mammalian+membrane+polyunsaturated+fatty+acid+composition+in+relation+to+membrane+fluidity+and+function.">The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).</li><li>Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+landscapes+and+pipelines+in+membrane+homeostasis.">Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis.</a> Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).</li><li>Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+lung+surfactant+where+it+belongs:+protein+regulation+of+two-dimensional+viscosity.">Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity.</a> Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cholesterol+nanodomains+on+monolayer+morphology+and+dynamics.">Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).</li><li>Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Lipid+Membrane+Viscosity+Using+Rotational+and+Translational+Probe+Diffusion.">Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion.</a> Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).</li><li>Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a., Schwartz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+needle+viscometer+for+Langmuir+monolayers.">Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers.</a> Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).</li><li>Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+interfacial+shear+microrheology+of+aging+protein+films.">Active interfacial shear microrheology of aging protein films.</a> Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+microrheology+of+DPPC+monolayers+at+the+air-water+interface.">Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface.</a> Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).</li><li>Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+microrheology+and+simultaneous+visualization+of+sheared+phospholipid+monolayers.">Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers.</a> Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).</li><li>Caruso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lateral+diffusion+coefficients+in+air-water+monolayers+by+fluorescence+quenching+measurements.">Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).</li><li>Filippov, A., Or&#228;dd, G., Lindblom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesterol+on+the+lateral+diffusion+of+phospholipids+in+oriented+bilayers.">The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers.</a> Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).</li><li>Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+single-molecule+sensitivity+on+cell+and+model+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes.</a> Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).</li><li>Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+experiments+under+conditions+of+uniform+disk+illumination.+Critical+comparison+of+analytical+solutions,+and+a+new+mathematical+method+for+calculation+of+diffusion+coefficient+D.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D.</a> Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).</li><li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+of+lipids+in+liquid+crystalline+phase+phosphatidylcholine+multibilayers.+A+comparison+of+experiment+with+theory.">Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory.</a> Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+in+phospholipid+multibilayers+measured+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).</li><li>Peters, R., Beck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+in+phospholipid+monolayers+measured+by+fluorescence+microphotolysis.">Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).</li><li>Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Methods of Chemistry. 1, Part 3B, 651-653 (1972).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).</li><li>Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+surface+tension+and+contact+angle+from+the+shapes+of+axisymmetric+fluid+interfaces.">Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces.</a> J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).</li><li>Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet:+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid/fluid+interfaces.">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

FRAM partage un grand nombre de principes fondamentaux avec FRAP, en particulier pour la mesure de la récupération de fluorescence après blanchiment d&#39;une zone spécifique, mais FRAM utilise un processus de fusion goutte sur l&#39;interface plane pour former une zone blanchie, au lieu d&#39;appliquer une lumière intense. Le processus de fusion est donc l&#39;étape la plus importante dans FRAM, et surtout, la forme de la tache sombre à la monocouche plat après la fusion d&#39;une gouttelette détermine la précision de la mesure de diffusivité. Plus précisément, sur la base d&#39;une méthode actuelle, nous ne fixons le cercle avec un rayon R comme une région d&#39;intérêt pour calculer l&#39;intensité moyenne de la tache sombre, montré dans la procédure 4, et si il ya un trop écart par rapport à la forme circulaire, ce serait perturber la mesure précise d&#39;un coefficient de diffusion. Par conséquent, il est nécessaire d&#39;obtenir une région sombre de forme circulaire, mais, des formes non circulaires sont formés de temps en temps pour plusieurs raisons. Tout d&#39;abord, si il existe un flux de convection dans le Petplat ri, la forme de la zone sombre devient allongée le long de la direction de l&#39;écoulement. Comme mentionné dans la procédure 1.3, un appareil en forme de cône aide à supprimer le flux de convection, et cet allongement serait minimisé. Deuxièmement, si l&#39;extrémité de la pointe capillaire de l&#39;interface en contact à plat au cours d&#39;un processus de fusion, la zone sombre est formé avec une variété de formes depuis l&#39;extrémité de capillaire interrompt le processus de fusion. En obtenant une gouttelette qui est seulement suspendu à partir de la fin du capillaire, cette interruption peut être empêchée. En particulier, un traitement hydrophobe du capillaire permet la gouttelette de siéger à la toute fin du capillaire. Par conséquent, des fusillades et des modifications de la panne ci-dessus nous permettent de mesurer les propriétés de diffusion plus précisément. Ce processus bien dépanné permet ainsi FRAM d&#39;avoir plusieurs avantages significatifs par rapport FRAP. Tout d&#39;abord, FRAM nécessite un équipement simple par rapport à FRAP. Pour FRAM, il suffit d&#39;utiliser un simple micros de fluorescencefaire face, au lieu d&#39;un microscope confocal cher avec un laser de forte puissance dont la longueur d&#39;onde doit correspondre avec le spectre d&#39;absorption du colorant. En outre, il est nécessaire d&#39;utiliser un appareil supplémentaire pour ajuster la taille de la zone blanchie dans la FRAP, tandis que le FRAM contrôle la taille de la zone facilement par ajustement de la taille de la goutte, ou la pression de surface à la surface des gouttelettes. Deuxièmement, il est possible d&#39;utiliser diverses espèces de colorants dans FRAM. FRAP utilise uniquement des molécules de colorant dont le processus de blanchiment est beaucoup plus rapide que le processus de diffusion. Si la diffusion des colorants se produit pendant le processus de blanchiment, il est difficile d&#39;estimer la propriété de diffusion de façon précise. Le FRAM, cependant, ne nécessite pas un procédé de décoloration des colorants, ce qui permet ainsi l&#39;utilisation de divers types de colorants dans l&#39;imagerie de fluorescence. En outre, le FRAP nécessite lasers de forte puissance supplémentaires et le filtre se met à changer les espèces tinctoriales, alors qu&#39;il est seulement nécessaire de remplacer les jeux de filtres dans la FRAM. finalementÉtant donné que les monocouches à la surface des gouttelettes et l&#39;interface plat peut être formé de façon indépendante, ce qui permet l&#39;étude de l&#39;inter-diffusion ou de mélange entre deux monocouches lipidiques différents par fusion de monocouche de type B monocouche de type A, tandis que le FRAP ne mesure la autodiffusion d&#39;une monocouche. Malgré ces avantages, le processus de fusion goutte sur une interface air-eau plat peut potentiellement limiter cette technique en raison de plusieurs questions qui pourraient être source de préoccupation, comme une incompatibilité de pression de surface entre les deux monocouches, l&#39;échelle de temps du processus de fusion et une augmentation de la pression de la monocouche de surface plate après la fusion des gouttelettes. Ces questions, cependant, ne portent pas atteinte à la mesure de la diffusion de manière significative pour les raisons suivantes. Tout d&#39;abord, même si les pressions de surface à deux monocouches différents sont tout à fait différent, un processus d&#39;équilibrage achevé à un stade très précoce au cours du processus de récupération. Par exemple, si til pression de surface de la monocouche sur la surface de la gouttelette est plus élevée que celle de la monocouche à l&#39;interface air-eau à plat, la zone sombre se développe jusqu&#39;à ce que la pression superficielle se équilibre. Etant donné que ce processus soit achevé dans les 10 ms, la pression de surface sera équilibrée avant qu&#39;il affecte le processus de diffusion de manière significative. Deuxièmement, si l&#39;échelle de temps du processus de fusion est suffisamment rapide, elle ne limite pas la mesure de la diffusion du tout. Heureusement, un processus de fusion typique est également terminé dans les 10 msec. Enfin, même multiple fusion des gouttelettes sur l&#39;interface plane ne pas augmenter la pression de surface depuis la surface de la cuvette est beaucoup plus grande que l&#39;aire de surface de la gouttelette. Selon les dimensions de l&#39;auge et les gouttelettes, décrit dans le protocole, l&#39;aire par molécule augmente de moins de 0,015% en fusion d&#39;une gouttelette. En conséquence, l&#39;augmentation de la pression de surface en raison de la modification de surface par molécule est inférieur à 0,1%, ce qui est negligible car elle est beaucoup plus petite que l&#39;erreur type de la pression de surface, telle que mesurée par plaque de Wilhelmy tensiomètre. En résumé, nous avons introduit une nouvelle méthode pour mesurer la propriété latérale de diffusion d&#39;une monocouche de phospholipides en fusionnant une monocouche de gouttelettes sur l&#39;interface plat. Cette technique nécessite un équipement relativement simple et permet également l&#39;utilisation de diverses sortes d&#39;espèces de colorants. Le FRAM est donc potentiellement applicable à la mesure de la diffusion de tous les agents tensio-actifs, y compris des phospholipides, des copolymères séquences, des protéines et même des nanoparticules à une interface liquide-liquide. En outre, nous nous attendons à ce que le FRAM offre une nouvelle façon d&#39;étudier l&#39;inter-diffusion ou de mélange entre deux agents actifs de surface différents.

<html> Les phospholipides sont des composants majeurs des membranes cellulaires et les membranes des organelles, et la fluidité de ces couches membranaires affecte souvent les fonctions cellulaires en modifiant l&#39;activité de protéines de la membrane 1 - 3. Par exemple, la membrane &#160; homéostasie lipidique est obtenue par le contrôle de la fluidité de la membrane, qui est détecté par les protéines de membrane, et un niveau anormal de fluidité provoque des maladies graves, telles que la stéatose hépatique et cholestase 4. En outre, la fluidité d&#39;une monocouche de phospholipides à l&#39;interface fluide-air alvéoles a des implications importantes dans ses fonctions. Haute fluidité du surfactant pulmonaire phospholipides monocouche facilite la propagation de la couche pendant l&#39;inhalation, tandis qu&#39;une fluidité à basse permet à la couche de rester dans les alvéoles lors de l&#39;expiration de 5,6. Il est donc important d&#39;évaluer la fluidité des couches de phospholipides de comprendre leurs rôles. _content &quot;&gt; Une mesure directe de la fluidité est la viscosité et la viscosité des couches de phospholipides a été mesurée en utilisant des colloïdes de taille micronique 7, aiguilles magnétiques 8,9, et les micro-boutons magnétiques 6,10,11. Cependant, ces techniques sont limités à des films relativement rigides, et ne peut pas mesurer les films moins visqueux. Pour de tels cas, diffusivité serait une alternative à quantifier la fluidité des couches de phospholipides. Depuis plusieurs décennies, une variété de techniques pour mesurer les propriétés de diffusion des couches de phospholipides ont été développés, tels que la fluorescence procédé de trempe 12, champ pulsé gradient RMN 13, et la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) 14. Une des méthodes les plus représentatifs est la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) 15,16. En raison de la simplicité de la procédure de mesure et connexes théories, plusieurs études sur les propriétés de diffusion des couches de phospholipides ont été effectuées en utilisant FRAP <sup&gt; 17 - 19. Cependant, FRAP nécessite généralement une configuration microscope confocal cher avec un laser de forte puissance. Ici, nous présentons une nouvelle technique pour mesurer la diffusion latérale de monocouches de phospholipides, appelé comme la récupération de fluorescence après la fusion (FRAM). La principale différence entre le FRAP et FRAM est que l&#39;étape de photoblanchiment est remplacé par la coalescence des gouttes. Fusion d&#39;une gouttelette couverte par des non-fluorescence monocouche sur une monocouche plat marqué par fluorescence laisse une tache sombre circulaire sur une monocouche appartement lumineux, mettant ainsi en place le même état initial avec l&#39;étape de photoblanchiment. On assiste alors à la récupération de fluorescence dans la tache sombre avec le temps pour mesurer la diffusivité latérale. Cette nouvelle &quot;blanchiment&quot; étape de coalescence de gouttes fournit des avantages significatifs par rapport FRAP: FRAM ne nécessite qu&#39;un microscope à fluorescence plutôt que d&#39;un microscope confocal cher avec un laser de forte puissance qui est nécessaire pour FRAP. jen outre, FRAM dispose d&#39;une large sélection de colorants fluorescents car elle ne comporte pas le processus de photoblanchiment. Enfin, les deux monocouches différentes, une monocouche de gouttelettes et une monocouche plat, peuvent être préparés de façon indépendante, ce qui permet interdiffusion à mesurer, tandis que FRAP ne mesure que l&#39;auto-diffusion de monocouches. FRAM offre une large gamme de mesures de diffusion à partir de matériaux très visqueux à des matériaux presque non-visqueux. A priori, FRAM peut mesurer la diffusivité maximum de 10 6 um 2 / sec, ce qui est comparable aux techniques existantes, lorsque la diffusion a lieu à travers la zone 100 um par 100 um pendant le temps pour le processus de coalescence de gouttes (~ 10 msec). En outre, lent processus de diffusion peut être facilement mesurée à moins monocouches sont solides. FRAM peut être utilisé pour toutes sortes de matières actives de surface aussi longtemps que les molécules étiquetées par fluorescence appropriés sont disponibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1288">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:269px;">OCI corporation</td>
			<td style="width:251px;">Acetone 3.8L Extra Pure</td>
			<td style="width:552px;">Purity: &#8805; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethanol</td>
			<td>OCI corporation</td>
			<td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td>
			<td>Purity: &#8805; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Deionized water/Water purify system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q liocel</td>
			<td>&#62;18.2 M&#937;&#903;cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Chloroform</td>
			<td>LiChrosolv</td>
			<td>Chloroform ultrapure (A3633)</td>
			<td>Purity: &#8805; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine DPPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C, 810158P</td>
			<td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wilhelmy plate tensiometer</td>
			<td>R&#38;K ultrathin organic film technology</td>
			<td>Wilhelmy tensiometer</td>
			<td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Micromanipulator 5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 1</td>
			<td>Objective lens: Olympus</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 2</td>
			<td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 1</td>
			<td>Jai</td>
			<td>CV 950 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 2</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter set</td>
			<td>Chroma technology</td>
			<td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td>
			<td>Prepare suitable for dye molecules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>Wiseclean WUC-D06H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

Une série d&#39;images de fluorescence ont été obtenus avec le temps au cours du processus de récupération après la fusion une gouttelette revêtue d&#39;une monocouche de DOPC sur un DOPC monocouche plat, comme indiqué dans la figure 1. La monocouche DOPC à l&#39;interface air-eau plate a été dopé avec de faibles quantités de rhodamine-DPPE, et cela a donc permis de visualiser un fond avec une couleur vive et une région sombre nouvellement ajouté à l&#39;interface plat. Là, un processus de récupération a été observée à 23 mN / m de surface de pression fixe. Un ajustement de l&#39;équation 1 à la modification de l&#39;intensité fractionnée en fonction du temps est représenté dans la figure 2. Le R 2 valeur de cet ajustement est de 0,999, ce qui forme fonctionne encore bien, même à des pressions de surface inférieurs ou supérieurs. Le coefficient de diffusion de la monocouche de DOPC obtenu à partir de cette forme fut 27,54 pm 2 / s à 23 mN / m de surface de pression. Pour de plus amples validation de la FRAM, coefficients de diffusion de la DODipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) et PC monocouches ont été mesurés selon la pression de surface. Comme le montre la Figure 3, FRAM capture la diminution rapide du coefficient de diffusion de la monocouche de DPPC à ~ 9 mN / m de la pression de surface, où une LC (liquide condensé) - LE (liquide élargi) transition de phase se produit 10, et les valeurs de coefficients de diffusion sont également bien d&#39;accord avec les mesures antérieurement par Peters et al., 19. En outre, une décroissance exponentielle du coefficient de diffusion de la pression de surface a été observée dans la monocouche de DOPC, et cette tendance est presque identique à celle mesurée par Caruso et al., 12. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> Figure 1. (A) Représentation schématique de la FRAM (récupération de fluorescence après la fusion) de la technique. Comme la lèvreid monocouche gouttelettes revêtu est fusionné à l&#39;interface air-eau plat, la monocouche lipidique sans fluorescence étiqueté lipidique est inséré dans fluorescent plat monocouche lipidique. Images (B) de fluorescence au microscope avec le temps au cours du processus d&#39;une monocouche de DOPC de récupération à 23 mN / m de la pression de surface (barre d&#39;échelle = 100 um). La région sombre de la monocouche de DOPC est entièrement récupéré par le processus de diffusion au sein de plusieurs minutes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;intensité fractionnaire en fonction du temps. Les cercles noirs et la ligne pointillée grise indiquent les valeurs d&#39;intensités des fractions obtenues à partir de l&#39;analyse d&#39;image (procédures 4.1 et 4.2) et l&#39;ajustement de l&#39;équation 1 aux intensités fractionnaires avec le temps,montré dans la procédure 4.3, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> Figure 3. Les coefficients de diffusion de DOPC (triangle) et DPPC (place vide) monocouches en fonction de la pression de surface. Les lignes avec la couleur gris clair et avec la couleur gris foncé indiquent les valeurs du coefficient de diffusion rapporté précédemment par Peters et al. et Caruso et al., respectivement. Ce chiffre a été modifié depuis Jeong et al. 23. Reproduit avec la permission de Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14369-14374. Droit d&#39;auteur 2014 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer sur son</a>e pour voir une version plus grande de cette figure.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Récupération de fluorescence après Fusionner une Droplet mesurer la Diffusion bidimensionnelle d&#39;une monocouche de phospholipides

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

fluorescence-recovery-after-merging-droplet-to-measure-two

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.0K vues.  KAIST. We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Vidéo: Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Recherche

Bio-ingénierie

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Synthèse, l&#39;Assemblée, et caractérisation des nanoparticules Monocouche protégées Films d&#39;or pour Electrochimie monocouche de protéines

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Une<em&gt; In Vitro</em&gt; Dosage enzymatique pour mesurer l&#39;inhibition de transcription par le gallium (III) et H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorophényl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient système de diffusion d&#39;enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Fusion Ion Concentration Polarisation entre juxtaposées échangeuses d&#39;ions Membranes pour bloquer la propagation de la Zone Polarisation

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...