De petites molécules de signalisation ciblent diverses protéines effectrices pour contrôler la virulence bactérienne et la biologie humaine. Cependant, ces protéines effectrices sont difficiles à identifier. En tant qu’outil de biologie des systèmes, DRaCALA permet une identification réalisable, rapide et très sensible des protéines effectrices inconnues à l’aide d’une bibliothèque OVium.
DRaCALA pourrait être utilisé pour étudier n’importe quelle petite molécule de signalisation tant qu’elle peut être étiquetée avec des isotopes radioactifs ou des colorants fluorescents. Commencez par inoculer E. coli en 1,5 millilitre de LB complété par 25 microgrammes par millilitre de chloramphénicol dans chaque puits de plaques de puits profondes de 96 puits pour une incubation nocturne à 30 degrés Celsius et 160 rotations par minute. Le lendemain matin, traiter les cultures de nuit avec 500 IPTG micromolaires pendant six heures à 30 degrés Celsius pour induire l’expression des protéines.
À la fin de l’incubation, arouillez les cellules par centrifugation, retirez le surnageant et congelez les échantillons à moins 80 degrés Celsius. Pour initier la lyse, resuspendez les granulés dans 150 microlitres de tampon de lyse un par puits pour une incubation de 30 minutes à moins 80 degrés Celsius avant de décongeler les cellules pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Le lysate doit ensuite être conservé à moins 80 degrés Celsius avant utilisation.
Pour compléter la lyse des cellules avec des protéines surexprimées, resuspendez les échantillons dans 40 millilitres de tampon de lyse glacée deux et soniquez les échantillons à une amplitude de 60% à deux secondes sur quatre secondes pendant huit minutes, puis nettoyez les lysates par centrifugation. Pendant que les échantillons sont en cours de centrifugation, ajoutez 500 microlitres de résine nickel-NTA homogénéisée à une colonne de chromatographie en polypropylène sur pied. Après 15 minutes, laver la résine déposée deux fois avec 15 millilitres d’eau ultrapure et une fois avec 15 millilitres de tampon de lyse deux.
À la fin de la centrifugation, chargez le surnageant de lysate dégagé sur la colonne. Lorsque tout le lysate a coulé à travers la colonne, lavez la colonne avec 30 millilitres de tampon de lavage. Pour éluer les protéines, ajoutez 400 microlitres de volume de tampon d’élution à la colonne et répétez l’élution trois fois.
Un autre volume de 300 microlitres du tampon d’élution pour répéter l’élution trois fois et combiner les protéines éluées dans un volume final de 700 microlitres. Pour la filtration sur gel de l’échantillon élué, après avoir lavé une colonne d’exclusion de taille avec 25 millilitres de tampon de filtration en gel fraîchement préparé, chargez tout le volume de protéine éluée sur la colonne à l’aide d’une boucle de 500 microlitres. Exécutez à 500 microlitres par minute et collectez deux à trois fractions volumiques de 500 microlitres des protéines respectives.
Ensuite, utilisez des colonnes de spin individuelles pour concentrer chaque protéine et utilisez le kit de dosage de Bradford pour mesurer les concentrations de protéines selon des protocoles standard. Pour synthétiser le pentaphosphate de guanosine marqué phosphore 32, assemblez une réaction Relseq à petite échelle dans un tube à bouchon à vis comme indiqué dans le tableau et incubez la réaction dans un ThermoMixer pendant une heure à 37 degrés Celsius et cinq minutes à 95 degrés Celsius, suivies de cinq minutes sur glace. À la fin des incubations, faire tourner la protéine précipitée par centrifugation et transférer le phosphore synthétisé 32 marqué guanosine pentaphosphate contenant un surnageant dans un nouveau tube à bouchon à vis.
Pour la synthèse du phosphore 32 guanosine tétraphosphate, ajouter un GppA micromolaire à la moitié du produit de guanosine pentaphosphate marqué phosphore 32 dans un nouveau tube à bouchon à vis et incuber la réaction pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius, cinq minutes à 95 degrés Celsius et cinq minutes sur glace. À la fin de l’incubation, faire tourner le précipité par centrifugation et transférer le phosphore 32 marqué guanosine tétraphosphate contenant un surnageant dans un nouveau tube. Pour analyser les protéines cibles isolées, exécutez un microlitre de chaque échantillon sur une plaque de chromatographie sur couche mince en utilisant 1,5 molaire de phosphate monopotassique comme phase mobile.
Après l’analyse, placez la plaque séchée dans un dossier en plastique transparent et exposez-la à un écran de phosphore de stockage pendant cinq minutes avant de visualiser et de quantifier les données sur un imageur au phosphore. Pour le criblage DRaCALA des protéines cibles, ajouter 20 microlitres de lysates en gros décongelés à des puits individuels d’une plaque de microtitrage à fond en V de 95 puits et ajouter 2,5 unités d’endonucléase serratia marcescens à chaque puits. Après 15 minutes à 37 degrés Celsius, placez les lysates sur de la glace pendant 20 minutes.
Ensuite, mélangez des volumes égaux de phosphore 32 marqué guanosine pentaphosphate et guanosine tétraphosphate et ajoutez un tampon de lyse 1X au mélange pour obtenir une solution de pentaphosphate de guanosine à quatre nanomolaires. À l’aide d’une pipette multicanal et d’embouts de pipette filtrés, mélanger 10 microlitres du mélange de guanosine pentaphosphate avec le lysate cellulaire pour une incubation de cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez un outil à broches 96X trois fois dans une solution à 0,01% de détergent non ionique pendant 30 secondes, suivi de 30 secondes de séchage sur une serviette en papier par lavage avant de placer l’outil à goupille dans la plaque d’échantillonnage de 96 puits.
Après 30 secondes, soulevez l’outil à broches vers le haut et placez-le directement sur une membrane de nitrocellulose pendant 30 secondes. Après cinq minutes de séchage, placez la membrane de nitrocellulose dans un dossier en plastique transparent pour stocker l’exposition à l’écran de phosphore et la visualisation par imagerie au phosphore, comme démontré. Pour quantifier et identifier les protéines cibles potentielles, dans le logiciel d’analyse associé à l’imageur de phosphore, ouvrez le fichier gel des plaques visualisées.
Pour définir les points à analyser, utilisez la fonction d’analyse de tableau pour configurer une grille de 12 colonnes sur huit lignes. Pour circonscrire le bord extérieur des taches de trou, définissez de grands cercles, exportez le volume ainsi que l’arrière-plan et la zone des grands cercles définis vers une feuille de calcul. Pour circonscrire les petits points intérieurs, réduisez la taille des cercles définis, exportez le volume ainsi que l’arrière-plan et la zone des petits cercles définis et enregistrez toutes les données dans la feuille de calcul.
Positionnez les cercles pour qu’ils se chevauchent avec les taches si nécessaire, en redimensionnant les taches légèrement plus grandes que les taches réelles. Utilisez l’équation pour calculer les fractions de liaison dans la feuille de calcul et tracer les données. Ensuite, identifiez les protéines de liaison potentielles dans les puits qui présentent des fractions de liaison élevées par rapport à la majorité des autres puits.
Dans cette analyse représentative, on peut observer une plaque avec des signaux de liaison de fond relativement faibles dans la plupart des puits. Le signal de liaison positif dans le puits H3 présentait une fraction de liaison beaucoup plus élevée que celle observée pour les autres puits en raison de la surexpression de la protéine de liaison à la guanosine pentaphosphate Hpt. Dans les plaques représentatives, plusieurs puits ont montré des signaux de liaison de fond relativement plus élevés, comme l’indiquent les points internes relativement forts observés dans de nombreux puits, ainsi que les fractions de liaison constamment élevées observées après quantification.
Notamment, certaines cibles ont également donné des fractions de liaison variables, telles que les faux positifs. Pour clarifier davantage, les chercheurs ont utilisé des protéines purifiées pour tester à nouveau la liaison. Une fois les protéines cibles identifiées, on peut les purifier en homogénéité et confirmer la force et la spécificité de l’interaction en utilisant DRaCALA, la calorimétrie de titrage isotherme ou d’autres méthodes.
L’identification des protéines cibles de petites molécules de signalisation ouvre la voie à une compréhension approfondie des rôles émergeant de la virulence bactérienne à la biologie humaine.
