Pour étudier les aspects biologiques du tissu adipeux brun, il est essentiel de nettoyer la taille adipeuse brune purifiée. Actuellement, aucune purification de taille adipeuse brune n’est venue et les masses sont disponibles. Dans cette étude, nous avons élaboré un protocole simple pour résoudre ce problème.
Maintenant, une compétence est requise pour ce protocole. Il nécessite beaucoup moins de matériaux d’étude que d’autres méthodes et la taille adipeuse brune purifiée peut être directement utilisée pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines. Ce protocole fournit une nouvelle méthode pour étudier la biologie de la taille adipeuse brune classique.
Il peut également être appliqué pour étudier le processus de brunissement des adipocytes blancs. La démonstration de la procédure sera Amanda, une assistante de recherche de mon laboratoire. Commencez par placer la fiole contenant la MTD et la solution de digestion sur un agitateur magnétique à 60 rotations par minute dans un incubateur à 35 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Utilisez une pipette d’un millilitre pour perturber les amas de tissus agrégés de tranches de MTD autour de la barre d’agitateur. Après la digestion, placez un filtre de crépine de 70 micromètres sur un tube à centrifuger propre de 50 millilitres et pipette environ quatre millilitres de suspension cellulaire à travers la crépine. Ensuite, lavez-le avec quatre millilitres de solution d’iodixanol à 12%.
Pipeter de haut en bas pour mélanger les cellules avec une solution d’iodixanol, puis transférer le mélange de cellules dans deux tubes à essai en polystyrène transparent de cinq millilitres. Placez les tubes de polystyrène contenant le mélange cellulaire sur de la glace pendant une heure, ce qui provoque la formation d’une couche sur le dessus des BA par les BA. Retirez 20 microlitres des BA isolés pour l’examen au microscope.
Pour l’isolement de l’ARN et des protéines, pipeter la couche BA dans deux tubes microcentriques de 1,7 millilitre. Ensuite, retirez délicatement la solution iodixonale excessive sans perturber la couche BA. Ensuite, ajoutez un millilitre de TRIzol dans la solution cellulaire pour isoler simultanément l’ARN, l’ADN et les protéines et mélanger suffisamment pour lyser les cellules.
Pour séparer les phases, ajoutez 200 microlitres de chloroforme et centrifugez dans le tube à 9 981 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, utiliser la phase aqueuse pour l’isolement de l’ARN. Transférez 300 microlitres de la phase organique dans un tube microcentrifuge de deux millilitres et ajoutez 750 microlitres d’éthanol à 100%.
Après avoir vortex pendant 10 secondes, ajoutez 200 microlitres de 1-Bromo-3-chloropropane et vortex à nouveau pendant 10 secondes. Ajouter 600 microlitres d’eau distillée double avant de vorer pendant 10 secondes. Laisser reposer la solution mélangée pendant 10 minutes à température ambiante.
Après centrifugation, ajouter 9,981 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Les phases seront séparées avec la phase protéique localisée dans la couche intermédiaire. Retirer la solution aqueuse supérieure et ajouter un millilitre d’éthanol à 100% dans la solution restante.
Après centrifugation à 9, 981 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, jeter le surnageant et laver la pastille avec un millilitre d’éthanol à 100%. Centrifuger à 9, 981 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, sécher à l’air libre le granulé pendant 10 minutes à température ambiante et mesurer le poids du granulé humide.
Ajouter une solution de FDS à 1% dans un rapport de 20 microlitres par milligramme de granulés. Dissoudre complètement la pastille en mettant le tube dans un shaker chauffé à 55 degrés Celsius et 11 G pendant cinq à 10 minutes. Dans le protocole, du PBS contenant 3 % de BSA a été utilisé pour séparer les BA des MTD.
Les cellules isolées étaient en forme de framboise avec des gouttelettes lipidiques multiloculaires à l’intérieur et étaient tdTom positives, confirmant qu’il s’agissait de BA. La protéine a été isolée des BA avec un protocole GTPC amélioré et a ensuite été examinée avec un gel SDS-PAGE. Une bande dominante associée à la BSA a été observée dans l’échantillon de BA, suggérant son interférence dans l’extraction des protéines.
Pour éviter les interférences BSA, une solution iodixonal à 6% a été utilisée pour l’isolement des BA, qui avaient une forme typique de framboise et contenaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires. Les protéines extraites de ces BA ont été bien séparées dans le gel SDS-PAGE. Ces cellules se sont avérées tdTomato positives alors que les cellules récupérées à partir de la pastille étaient tdTomato négatives sans gouttelettes lipidiques évidentes, suggérant une séparation efficace des BA des cellules non adipeuses.
Dans l’analyse de l’expression génique, les niveaux d’ARNm de UCP1 et PDGFA étaient significativement plus élevés dans les BA isolés. Mais l’ARNm de PDGFRA n’a été détecté que dans les MTD. La protéine UCP1 a été trouvée enrichie dans des BA isolés.
L’EDGFR alpha a été détecté dans les MTD, mais pas dans les BA isolées. Ces résultats confirment l’efficacité de la méthode d’isolement des BA et démontrent que les BA isolés conviennent aux études d’expression génique et protéique. Lorsque vous essayez ce protocole, utilisez un tampon de digestion frais pour dissocier le tissu adipeux brun et éviter la formation d’amas tissulaires pendant la période de digestion.
Cette nouvelle méthode facilite l’étude de la biologie du tissu adipeux brun au niveau du robinet unicellulaire. En appliquant cette méthode, on peut effectuer des études d’expression GN et protéique avec des adipocytes bruns purs disséquant précisément le programme d’expression génique des adipocytes bruns, sans se soucier de la contamination à l’origine par des cellules non adipeuses.
