L’installation XChem de Diamond Light Source fournit un criblage de routine à grande échelle des fragments graphiques cristallins, prenant en charge l’ensemble du processus de dépôt de cristaux. La cristallographie aux rayons X est un élément essentiel de la boîte à outils FBDD. Il est suffisamment sensible pour identifier les liants faibles et fournit directement des informations structurelles sur les interactions au niveau moléculaire.
La découverte de médicaments à partir de fragments est une stratégie largement utilisée pour la découverte de prospects. Elle a livré six médicaments à usage clinique et plus de 50 molécules ont fait l’objet d’essais cliniques. L’impact des avancées et de l’efficacité fournies par la plate-forme XChem par rapport aux méthodes traditionnelles de trempage, de collecte et d’analyse des données est mieux démontré visuellement.
Commencez par choisir l’emplacement des cristaux et du composé. Ouvrez TextRank à partir d’un PC et sélectionnez le plateau en cristal, soit dans la liste en bas à droite, soit en tapant le code-barres dans la case en haut à gauche. Sélectionnez le format d’image approprié et la vue à puits unique.
Pour ajouter du solvant ou des composés à une goutte sans toucher le cristal, cliquez avec le bouton droit de la souris à l’intérieur de la goutte, mais loin du cristal lorsqu’un cristal approprié pour une expérience est trouvé en vous déplaçant dans les images de la goutte. Ouvrez le logiciel Echo et sélectionnez de nouvelles solutions pour distribuer à l’aide du distributeur acoustique. Choisissez la bonne plaque de puits source et la classe de liquide.
Assurez-vous que le type de plaque correct est sélectionné comme plaque de destination. Cochez ensuite la case personnalisée et continuez. Sélectionnez Importer, puis choisissez le fichier batch approprié.
Effectuez ensuite les étapes d’importation comme demandé par le logiciel. Utilisez les cartes des plaques pour vérifier la solution à distribuer et les emplacements de destination. Exécutez ensuite le protocole en suivant les invites au fur et à mesure qu’elles s’affichent.
Les solutions de la plaque source seront distribuées dans les gouttes de cristal choisies. Conservez l’assiette dans l’incubateur pendant le temps requis. Pour récolter les cristaux à l’aide du dispositif semi-automatique de récolte de cristaux, appuyez sur le bouton de démarrage du flux de travail pour passer à la première position de puits sélectionnée.
Si le cristal a survécu, montez-le dans la boucle et plongez-le dans l’azote liquide, en le plaçant en position 1 dans la première rondelle de la liste. Sélectionnez la description appropriée pour le cristal dans l’interface. S’il s’agit d’un trempage composé, notez la description de l’état composé.
Si le cristal a été monté avec succès, sélectionnez monté, sinon, sélectionnez échec. Une fois que les cristaux ont été récoltés, apportez les rondelles au lecteur de codes-barres et placez-les dans le support une à la fois pour scanner la rondelle et épingler les codes-barres. Une fois le balayage terminé, placez les couvercles sur les rondelles et stockez-les dans un réservoir de stockage d’azote liquide.
Pour vous souvenir des échantillons mal centrés, examinez la vue du passeur d’échantillons dans ISPyB et sélectionnez Classer en fonction de la résolution AP pour classer les échantillons en fonction de la résolution du traitement automatique dans une gradation de couleur allant du vert au rouge. Cliquez sur les échantillons pour vérifier s’il y a des échantillons rouges ou jaunes. Vérifiez ensuite les instantanés du cristal pour voir si le cristal a été centré.
Pour récupérer et analyser les résultats du traitement automatique de Diamond via XChem Explorer ou XCE, dans un terminal, allez dans le sous-dossier processing et utilisez l’alias XCE pour ouvrir XChem Explorer. Sélectionnez le bouton Mettre à jour les tables à partir de la source de données dans l’onglet Vue d’ensemble pour actualiser le résumé des données expérimentales. Sous l’onglet Paramètres, sélectionnez le répertoire de collecte de données, ouvrez l’onglet Jeux de données.
Choisissez la cible dans le menu déroulant Sélectionner une cible, sélectionnez Obtenir de nouveaux résultats à partir du traitement automatique dans le menu déroulant Jeux de données, puis cliquez sur Exécuter. Pour calculer les cartes initiales à l’aide de l’option Fossette, ouvrez l’onglet Cartes, choisissez le modèle de référence dans le menu déroulant et sélectionnez les jeux de données souhaités, puis exécutez l’option Fossette sur les fichiers MTZ sélectionnés. Pour générer des restrictions de ligand, sélectionnez les jeux de données souhaités, puis créez un fichier SCF, PDB ou PNG des composés sélectionnés dans la liste déroulante Cartes et contraintes.
Pour identifier les accès à l’aide de Panda, sélectionnez l’onglet Pandas, assurez-vous que le répertoire de sortie est correctement défini et exécutez panda. Analysez à partir du menu déroulant Identification des résultats. Pour analyser les accès identifiés par Panda, exécutez panda.
Inspectez à partir du menu déroulant Identification de l’accès. Pour ouvrir Coot avec le panneau de configuration Panda. Cartes de charge moyenne et 2mFo-DFc de Dimple pour comparaison avec la carte et le modèle d’événements.
Une fois qu’un ligand a été ajusté, cliquez sur fusionner le ligand avec le modèle et enregistrer le modèle avant de passer à un autre événement pour éviter de perdre les modifications apportées au modèle d’état lié. Annotez l’événement de liaison à l’aide du champ de commentaire d’événement et annotez les sites de liaison à l’aide des informations sur le site d’enregistrement. Une fois que tous les ligands viables ont été modélisés, fusionnés et enregistrés sur la base de la carte des événements, fermez panda.inspect.
Exportez les modèles d’inspection Panda dans le répertoire du projet et lancez un premier tour d’affinement pour les jeux de données sélectionnés, et l’affinement sera désormais visible dans l’onglet d’affinement. Le pipeline XChem pour le criblage de fragments par cristallographie aux rayons X a été considérablement rationalisé, ce qui a permis son adoption par la communauté scientifique. Ce graphique illustre l’adoption et la consolidation du programme utilisateur de 2015 à 2019 avec la création de groupes d’allocation de blocs en 2019 et la résilience de la plateforme pendant la pandémie de COVID-19 en 2020.
Les campagnes réussies permettent d’obtenir une carte tridimensionnelle des sites d’interaction potentiels sur la protéine cible. Un résultat typique est le criblage XChem de la protéase principale du SRAS-CoV-2. Les sites d’intérêt connus, tels que les sites actifs enzymatiques et les sous-poches, sont indiqués en jaune.
Les sites allostériques putatifs, tels que ceux impliqués dans les interactions protéine-protéine, sont représentés en magenta et les interfaces d’empilement cristallin, généralement considérées comme des faux positifs, sont indiquées en vert. Historiquement, l’utilisation de la cristallographie comme crible primaire de fragments a été difficile. Cette étude a documenté les protocoles de pipeline XChem, de la préparation de l’échantillon aux structures finales.
Le criblage de fragments cristallographiques complète d’autres techniques biophysiques et est généralement essentiel pour faire progresser les fragments jusqu’aux composés de plomb. Il peut être appliqué à n’importe quelle classe cible de découverte de médicaments.
