À notre connaissance, il s’agit du premier exemple de protocole de multiplexage à base de billes qui utilise deux signaux rapporteurs pour mesurer simultanément deux résultats par analyte. Cette technique permet à l’utilisateur de mesurer les IgM et les IgG spécifiques à l’antigène en même temps, avec moins d’échantillon et un délai de résultats plus court. Bien que cette méthode à double rapporteur soit spécifique à l’isotypage des anticorps, elle pourrait être adaptée pour mesurer d’autres paires d’analytes, telles que des modifications post-traductionnelles ou des formes médicamenteuses libres ou liées.
Nous avons fait la démonstration de notre procédure aujourd’hui avec le Dr Steve Angeloni, un scientifique principal d’application sur le terrain pour Luminex Corporation. Pour commencer le double test sérologique IgG et IgM, préparez les mélanges de billes multiplex requis à partir des billes de couple individuelles et contrôlez les stocks de perles à une concentration d’une fois 10 à six perles par millilitre. Ensuite, diluez les échantillons de sérum 100 fois en ajoutant 10 microlitres de sérum à 990 microlitres de tampon PBS-TBN, puis diluez les échantillons encore dix fois en ajoutant 20 microlitres de la dilution 1:100 à 180 microlitres de PBS-TBN.
Lorsque les mélanges de billes et les échantillons de sérum sont prêts, ajoutez 50 microlitres des mélanges de billes multiplex aux puits assignés d’une plaque de microtitrage non contraignante de 96 puits, puis ajoutez 50 microlitres des échantillons de sérum dilués aux puits appropriés. Une fois que tous les échantillons ont été ajoutés, recouvrir la plaque d’un joint en feuille de microplaque et incuber sur un agitateur à plaque chauffante à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, séparez les billes du mélange réactionnel en plaçant la plaque sur un séparateur de plaques magnétiques pendant deux minutes.
En gardant la plaque sur l’aimant, retirez le joint d’aluminium. Ensuite, inversez soigneusement la plaque sur un conteneur à déchets et faites glisser doucement le surnageant hors des puits. Tout en maintenant la plaque sur l’aimant, épongez la plaque sur du papier absorbant.
Pour laver les puits de réaction, retirez la plaque de l’aimant de la plaque et ajoutez 150 microlitres de PBS-TBN à chaque puits. Couvrez la plaque avec un joint d’aluminium frais et incubez sur le shaker chauffé pendant deux minutes avant de le replacer sur l’aimant de la plaque pendant deux minutes supplémentaires. Tout en gardant la plaque sur l’aimant, inversez la plaque pour jeter le surnageant et épongez la plaque sur du papier absorbant.
Après le deuxième lavage PBS-TBN, retirez la plaque de l’aimant et ajoutez 100 microlitres de mélange de réactif de détection frais à chaque puits. Après avoir recouvert la plaque d’un joint en feuille de microplaque, placez-la sur un agitateur à plaque chauffante pendant 15 minutes, puis sur un séparateur de plaque magnétique pendant deux minutes. Pendant que la plaque est sur l’aimant, jetez le mélange de réactif de détection en inversant la plaque sur un récipient à déchets et en l’épongeant sur du papier absorbant.
Lavez les puits de réaction avec pbS-TBN deux fois comme démontré précédemment, puis retirez la plaque de l’aimant. Ajouter 100 microlitres de PBS-TBN à chaque puits, puis couvrir la plaque avec un joint de feuille et agiter pendant deux minutes à 37 degrés Celsius. Retirez le joint d’étanchéité et procédez à la lecture de 50 microlitres de l’échantillon de chaque puits de l’analyseur de débit.
Pour lire la plaque, sélectionnez le menu déroulant dans le coin supérieur gauche, accédez à Configuration de la plaque, chargez la plaque précédemment configurée, puis sélectionnez Exécuter la plaque. Éjectez le support de plaque en sélectionnant l’icône Éjecter, puis chargez la plaque sur le support de plaque et sélectionnez l’icône Rétracter pour rétracter le support de plaque. Une fois que le support de plaque s’est prolongé dans l’analyseur, sélectionnez l’icône Exécuter pour commencer à lire la plaque.
Pour le test de neutralisation à double rapporteur, ajoutez 50 microlitres des mélanges de billes multiplex aux puits assignés d’une plaque de microtitrage non contraignante de 96 puits, puis ajoutez 25 microlitres de deux microgrammes par millilitre ACE2 à chaque puits et recouvrez la plaque d’un joint d’aluminium. Après une incubation de deux minutes sur un agitateur à plaque chauffante, ajouter 25 microlitres de dilutions sériques de 1:500 aux puits assignés. Une fois que tous les échantillons ont été ajoutés, effectuez les étapes d’incubation, de lavage, de détection et d’analyse comme démontré précédemment pour le test sérologique.
Un test d’anti-IgM conjugué au colorant rapporteur DyLight 405 utilisant des échantillons de sérum dans les cinq à 60 jours suivant l’apparition des symptômes et un échantillon de sérum de bande d’IgG n’a pas produit de signal élevé pour l’antigène de pointe. Pour les échantillons avec une intensité de fluorescence moyenne IgM élevée, les signaux les plus élevés ont été observés pour le domaine de liaison au récepteur et les antigènes nucléocapsides. Bien que le titre d’IgM aurait dû être élevé dans certains échantillons, les niveaux d’intensité de fluorescence moyenne observés ne dépassaient pas 140 unités MFI.
De plus, la bille témoin pour les IgM n’avait pas de plage dynamique significative pour l’intensité médiane de fluorescence lors de l’utilisation de DyLight 405 conjugué à des anti-IgM par rapport à une phycoérythrine marquée anti-IgM à la même concentration. Pour la détection des IgG, le conjugué violet brillant avait des signaux d’intensité de fluorescence médiane plus élevés que le conjugué de streptavidine du fluorphore Super Bright 436. Cependant, l’intensité du signal pour le conjugué violet brillant variait d’un titrage ACE2 à l’autre.
Cette fluctuation du signal par le conjugué violet brillant à travers les concentrations d’ACE2 a également interféré avec la détermination du pourcentage d’inhibition par ACE2 dans la gamme des titres d’IgG. Pour la détection des IgM, les anti-IgM de phycoérythrine affichaient des signaux plus élevés que ceux générés par les IgM anti-humaines DyLight 549. Lors de la détermination de l’inhibition de l’ACE2 pour cent de la liaison aux IgM, il y avait une différence légère mais insignifiante entre les deux réactifs de détection des IgM.
L’une des étapes les plus importantes de la procédure consiste donc à préparer votre mélange de billes multiplexes à partir de vos stocks de perles individuels et à vous assurer de le faire correctement. Ainsi, cette procédure peut également être utilisée pour mesurer l’efficacité des vaccins et surveiller les réponses immunitaires à d’autres agents pathogènes.
