L’étude d’une plus grande population s’accompagne d’une variation entraînée par la machine, qui est donc la variation réelle provenant de la diversité naturelle. Nous démontrons ici une méthode pour réduire la variation technique pour l’analyse d’intégration en aval. Les avantages de cette technique comprennent une extraction basée sur la séparation faciale, fournissant l’analyse de divers métabolites sur la plate-forme analytique respective, tout en supprimant l’erreur systémique et en maintenant la variance biologique.
Une fois que les informations génotypiques et phénotypiques sont obtenues, cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle population naturelle diversifiée dans n’importe quel royaume de la vie. Pour commencer, prenez des tubes de récolte de 20 millilitres, ajoutez deux billes métalliques de cinq millimètres et deux de huit millimètres de diamètre pour homogénéiser et étiquetez les tubes. Ensuite, remplissez un dewar avec de l’azote liquide, immédiatement après avoir coupé la récolte d’échantillons de feuilles fraîches et de tissus racinaires dans de l’azote liquide par congélation éclair.
Conservez les échantillons biologiques récoltés à 80 degrés Celsius pour un traitement ultérieur. Pré-refroidir les porte-tubes dans de l’azote liquide. Ensuite, broyer les tissus à 25 hertz pendant une minute pour obtenir une poudre homogène.
Répétez la congélation et le broyage si le tissu n’est pas broyé de manière homogène. Peser 50 milligrammes de matière végétale fraîche dans des tubes de microcentrifugation de sécurité pré-refroidis de deux millimètres, garantissant que la matière végétale reste congelée pendant le processus de pesée. Ajouter un millilitre de mélange d’extraction pré-refroidi de 1 à 50 milligrammes d’aliquote de l’échantillon, et vortexer brièvement le tube avant de le garder sur la glace.
Incuber les échantillons sur un agitateur orbital à 800 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, suivi d’une sonication dans un bain de sonication refroidi par la glace pendant 10 minutes. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 500 microlitres de mélange d’extraction aux échantillons et mélangez les extraits par un bref vortex, puis centrifugez le mélange à 11 200 fois G pendant 5 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, transférer 500 microlitres de la phase supérieure séparée contenant des lipides dans un tube de microcentrifuge à verrouillage de sécurité pré-marqué de 1,5 millilitre, en retirant le reste de la phase supérieure.
Dans des tubes de microcentrifugation séparés de 1,5 millilitre de sécurité, 150 microlitres de la phase semi-polaire inférieure quatre GCMS et 300 microlitres de la phase semi-polaire quatre U-H-P-L-C MS analyse. Utilisez un concentrateur sous vide pour l’évaporation du solvant afin de concentrer toutes les fractions extraites sans chauffage et stockez les fractions séchées à 20 degrés Celsius. Pour préparer l’échantillon à ultra-haute performance, la chromatographie liquide, la spectrométrie de masse ou H-P-L-C MS remettent en suspension les fractions semi-polaires séchées dans 180 microlitres d’un mélange de méthanol et d’eau.
Soniquez ensuite la phase semi-polaire pendant 2 minutes, suivie d’une centrifugation à 11 200 fois G pendant une minute. Après centrifugation, transférer 90 microlitres du surnageant dans un flacon en verre et injecter deux microlitres d’extraits dans l’échantillon LCMS versé. Effectuer le fractionnement des métabolites sur une colonne de phase C18 inversée maintenue à 40 degrés Celsius, et un débit de 400 microlitres par minute avec des changements progressifs de l’effluent A et B, acquérir les spectres de masse du blanc d’essai et des échantillons de contrôle de la qualité en mode d’ionisation négative avec une plage de masse de 102 1500 rapport masse/charge.
Pour les échantillons de métabolites semi-polaires, exécutez un échantillon de CQ groupé en spectrométrie de masse en tandem dépendante des données en modes d’ionisation négative et positive. Utilisez les spectres de masse obtenus pour l’annotation. Effectuez la normalisation de l’ensemble de données en vérifiant la distribution de la norme interne.
Normalisez les données en corrigeant le signal d’une ou de plusieurs normes internes. Ensuite, corrigez les intensités de crête obtenues à partir du chromatogramme sur le poids exact de l’échantillon. Pour corriger la dérive d’intensité sur des séries multi-lots, effectuez des méthodes de correction basées sur le QC, telles que le lissage du nuage de points estimé localement à l’aide de R.Avant d’effectuer des études d’association à l’échelle du génome ou GWAS, filtrez les données génotypiques pour les fréquences d’allèles mineures inférieures à 5% et un taux manquant de plus de 10% en utilisant le gland.
Cela évitera les biais de basse fréquence. Pour éliminer le biais provenant des facteurs environnementaux, utilisez le paquet R LME four et calculez les meilleures prédictions ou blops linéaires et impartiaux pour chaque caractéristique normalisée au cours des répétitions expérimentales. Utilisez des blops de chaque caractéristique individuellement pour effectuer GWAS avec le package rMVP dans R.Les données lipidomiques de plusieurs espèces de haricots communes sont affichées sur la base des chromatogrammes de pic de base bruts de deux échantillons QC de lots différents.
Une variation de l’intensité du signal a été observée pour certaines classes lipidiques. L’erreur systémique était plus évidente lorsque l’analyse en composantes principales était effectuée sur les données brutes. La procédure de normalisation, y compris le lissage du nuage de points estimé localement, a conduit au regroupement des échantillons de CQ.
Lors de la dissection dans les clusters individuels, les erreurs pilotées par machine dans les lots sept et huit sont devenues claires avant la normalisation, qui a été corrigée. Les amas métabolomiques individuels post-normalisés et transformés ont été utilisés pour le GWAS, ce qui a donné lieu à plusieurs associations de marqueurs de caractères. Dans l’analyse représentative, différentes classes de composés sont mises en évidence dans différentes couleurs, tandis que les marqueurs associés à plusieurs classes de composés sont indiqués avec son gène le plus proche.
La normalisation et la transformation des données sont l’une des étapes les plus importantes. S’assurer qu’une correction appropriée a été effectuée pour corriger les erreurs systémiques et assurer la normalité de la distribution. En effectuant la correction de la variation analytique, plusieurs approches d’intégration peuvent être effectuées, telles que l’analyse de corrélation métabolique et l’intégration dans les données phénomiques pour faire la lumière sur des traits complexes.
