Investigar população maior vem com uma variação orientada por máquinas, que por isso a variação real originária da diversidade natural. Aqui demonstramos um método para reduzir a variação técnica para análise de integração a jusante. As vantagens dessa técnica incluem uma extração baseada em separação facial, fornecendo a análise de vários metabólitos na respectiva plataforma analítica, removendo o erro sistêmico e mantendo a variância biológica.
Uma vez que as informações genotípicas e fenotípicas são obtidas, este método pode ser aplicado a qualquer população natural diversificada em qualquer reino da vida. Para começar, pegue tubos de colheita de 20 mililitros, adicione dois cinco milímetros e duas contas metálicas de oito milímetros de diâmetro para homogeneizar e rotular os tubos. Em seguida, encha uma de guerra com nitrogênio líquido, imediatamente após cortar amostras de folhas frescas e tecido raiz em nitrogênio líquido por congelamento relâmpago.
Armazene as amostras biológicas colhidas a 80 graus celsius para posterior processamento. Pré-esfrie os suportes do tubo em nitrogênio líquido. Em seguida, triture os tecidos a 25 hertz por um minuto para obter um pó homogêneo.
Repita o congelamento e a moagem se o tecido não estiver homogêneo. Pese 50 miligramas de material vegetal fresco em um pré-refrigerado rotulado dois milímetros de tubos de microcentrifus de bloqueio seguro, garantindo que o material vegetal permaneça congelado durante o processo de pesagem. Adicione um mililitro de mistura de extração pré-resfriada de 1 a 50 miligramas aliquot da amostra, e vórtice do tubo brevemente antes de manter no gelo.
Incubar as amostras em um agitador orbital a 800 vezes G por 10 minutos a quatro graus celsius, seguido de sônica em um banho de sônica resfriado por gelo por 10 minutos. Use uma pipeta multicanal para adicionar 500 microliters de mistura de extração também às amostras e misturar os extratos por um breve vórtice, depois centrifugar a mistura a 11.200 vezes G por 5 minutos a quatro graus celsius. Após a centrifugação, transfira 500 microlitres da fase superior separada contendo lipídios para um tubo de microcentrifuge de bloqueio seguro de 1,5 mililitro pré-rotulado, removendo o resto da fase superior.
Em tubos de microcentrifus de bloqueio seguro separados de 1,5 mililitros transferem 150 microliters da fase semi-polar inferior quatro GCMS e 300 microliters da fase semi-polar quatro análises U-H-P-L-C MS. Use um concentrador de vácuo para evaporação de solventes para concentrar todas as frações extraídas sem aquecimento e armazenar as frações secas a 20 graus celsius. Para preparar a amostra para cromatografia líquida de desempenho ultra-alto, espectrometria de massa, ou H-P-L-C MS suspender as frações semipolarizadas secas em 180 microliters de uma mistura de metanol e água.
Em seguida, sonicar a fase semi-polar por 2 minutos, seguido de centrifugação a 11.200 vezes G por um minuto. Após a centrifugação, transfira 90 microlitres do supernatante para um frasco de vidro e injete dois microliters dos extratos na amostra LCMS derramada. Realize o fracionamento metabólico em uma coluna de Fase C18 invertida mantida a 40 graus celsius, e um fluxo de 400 microliters por minuto com mudanças graduais de efluente A e B, adquira o espectro de massa das amostras de teste em branco e controle de qualidade em modo de ionização negativa com uma faixa de massa de 102 1500 massas para a razão de carga.
Para as amostras de metabólitos semipolares, execute uma amostra de QC agrupada em espectrometria de massa tandem dependente de dados em modos de ionização negativa e positiva. Use o espectro de massa obtido para a anotação. Realize a normalização dos dados definidos verificando a distribuição do padrão interno.
Normalize os dados corrigindo o sinal de padrões internos únicos ou múltiplos. Em seguida, corrija as intensidades máximas obtidas do cromatograma sobre o peso exato da amostra. Para corrigir a deriva de intensidade em séries multimacículas, execute métodos de correção baseados em QC, como a suavização de dispersão localmente estimada usando R.Antes de realizar estudos de associação genoma-em todo o genoma ou GWAS, filtrar os dados genotípicos para pequenas frequências de alelo inferior a 5% e uma taxa de falta de mais de 10% usando tassel.
Isso evitará viés de baixa frequência. Para eliminar o viés originário dos fatores ambientais, utilize o pacote R LME quatro e calcule as melhores previsões lineares e imparcial ou blops para cada característica normalizada sobre as repetições experimentais. Use blops de cada recurso individualmente para executar GWAS com o pacote rMVP em R.Os dados lipidómicos em várias espécies comuns de feijão são mostrados com base nos cromogramas de pico de base bruta de duas amostras de QC de diferentes lotes.
Observou-se variação nas intensidades do sinal para determinadas classes lipídicas. O erro sistêmico ficou mais evidente quando a análise dos componentes principais foi realizada nos dados brutos. O procedimento de normalização, incluindo a suavização de dispersão localmente estimada, levou ao agrupamento das amostras de QC.
Ao dissecar nos clusters individuais, os erros orientados por máquina no lote sete e oito ficaram claros antes da normalização, que foi corrigida. Os clusters metabolômicos individuais pós-normalizados e transformados foram utilizados para GWAS, rendendo em várias associações de marcadores de características. Na análise representativa, diferentes classes compostas são destacadas em cores diferentes, enquanto os marcadores associados a múltiplas classes compostas são indicados com seu gene mais próximo.
A normalização e transformação dos dados são um dos passos mais importantes. Certifique-se de que a correção adequada tenha sido realizada para corrigir erros sistêmicos e garantir a normalidade na distribuição. Ao realizar a correção para a variação analítica, podem ser realizadas diversas abordagens de integração, como análise de correlação metabólica e integração em dados fenômicos para esclarecer traços complexos.
