Lo studio di una popolazione più ampia viene fornito con una variazione guidata dalla macchina, che da questo la variazione effettiva proviene dalla diversità naturale. Qui dimostriamo un metodo per ridurre la variazione tecnica per l'analisi dell'integrazione a valle. I vantaggi di questa tecnica includono un'estrazione basata sulla separazione facciale, che fornisce l'analisi di vari metaboliti sulla rispettiva piattaforma analitica, rimuovendo l'errore sistemico e mantenendo la varianza biologica.
Una volta ottenute le informazioni genotipiche e fenotipiche, questo metodo può essere applicato a qualsiasi popolazione naturale diversificata in qualsiasi regno della vita. Per iniziare prendi tubi di raccolta da 20 millilitri, aggiungi due perline metalliche da cinque millimetri e due da otto millimetri di diametro per omogeneizzare ed etichettare i tubi. Quindi, riempire un dewar con azoto liquido, subito dopo aver tagliato raccogliere campioni di foglie fresche e tessuto radicale in azoto liquido mediante congelamento lampo.
Conservare i campioni biologici raccolti a 80 gradi Celsius per un'ulteriore lavorazione. Pre-raffreddare i portatubi in azoto liquido. Quindi, macinare i tessuti a 25 hertz per un minuto per ottenere una polvere omogenea.
Ripetere il congelamento e la macinazione se il tessuto non è macinato in modo omogeneo. Pesare 50 milligrammi di materiale vegetale fresco in un microcentrifuga di blocco sicuro pre-raffreddato con etichetta a due millimetri, assicurando che il materiale vegetale rimanga congelato durante il processo di pesatura. Aggiungere un millilitro di miscela di estrazione pre-raffreddata da 1 a 50 milligrammi di aliquota del campione e ruotare brevemente il tubo prima di mantenere il ghiaccio.
Incubare i campioni su uno shaker orbitale a 800 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, seguito da sonicazione in un bagno di sonicazione raffreddato a ghiaccio per 10 minuti. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere anche 500 microlitri di miscela di estrazione ai campioni e mescolare gli estratti mediante breve vortice, quindi centrifugare la miscela a 11.200 volte G per 5 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, trasferire 500 microlitri della fase superiore separata contenente lipidi in un tubo microcentrifuga di blocco sicuro pre-marcato da 1,5 millilitri, rimuovendo il resto della fase superiore.
In tubi microcentrifuga a blocco sicuro separati da 1,5 millilitri trasferiscono 150 microlitri della fase semipolare inferiore quattro GCMS e 300 microlitri della fase semipolare quattro analisi U-H-P-L-C MS. Utilizzare un concentratore sottovuoto per l'evaporazione con solvente per concentrare tutte le frazioni estratte senza riscaldamento e conservare le frazioni essiccate a 20 gradi Celsius. Per preparare il campione per prestazioni ultra-elevate, cromatografia liquida, spettrometria di massa o H-P-L-C MS, sospendere nuovamente le frazioni semipolari essiccate in 180 microlitri di una miscela di metanolo e acqua.
Quindi sonicare la fase semipolare per 2 minuti, seguita da centrifugazione a 11,200 volte G per un minuto. Dopo la centrifugazione, trasferire 90 microlitri del surnatante in una fiala di vetro e iniettare due microlitri degli estratti nel campione LCMS versato. Eseguire il frazionamento del metabolita su una colonna di fase C18 invertita mantenuta a 40 gradi Celsius e un flusso di 400 microlitri al minuto con variazioni graduali degli effluenti A e B, acquisire gli spettri di massa del bianco di prova e campioni di controllo qualità in modalità di ionizzazione negativa con un intervallo di massa di 102 1500 rapporto massa/carica.
Per i campioni di metaboliti semipolari, eseguire un campione QC aggregato in spettrometria di massa tandem dipendente dai dati in modalità di ionizzazione negativa e positiva. Utilizzare gli spettri di massa ottenuti per l'annotazione. Eseguire la normalizzazione del set di dati controllando la distribuzione dello standard interno.
Normalizzare i dati correggendo il segnale di uno o più standard interni. Quindi, correggere le intensità di picco ottenute dal cromatogramma sul peso esatto del campione. Per correggere la deriva dell'intensità tra serie multi-batch, eseguire metodi di correzione basati su QC come l'smoothing dello scatterplot stimato localmente utilizzando R.Prima di eseguire studi di associazione a livello di genoma o GWAS, filtrare i dati genotipici per frequenze alleliche minori inferiori al 5% e un tasso mancante superiore al 10% utilizzando la nappa.
Ciò eviterà la distorsione a bassa frequenza. Per eliminare il pregiudizio derivante dai fattori ambientali utilizzare il pacchetto R LME quattro e calcolare le migliori previsioni lineari e imparziali o blobp per ogni caratteristica normalizzata rispetto alle ripetizioni sperimentali. Utilizzare i blob di ciascuna funzionalità singolarmente per eseguire GWAS con il pacchetto rMVP in R.I dati lipidomici su diverse specie di fagioli comuni sono mostrati in base ai cromatogrammi di picco di base grezza di due campioni QC di lotti diversi.
È stata osservata una variazione delle intensità del segnale per alcune classi lipidiche. L'errore sistemico è stato più evidente quando è stata eseguita l'analisi delle componenti principali sui dati grezzi. La procedura di normalizzazione, compresa la levigatura del grafico a dispersione stimata localmente, ha portato al raggruppamento dei campioni QC.
Durante la dissezione nei singoli cluster, gli errori guidati dalla macchina nei lotti sette e otto sono diventati chiari prima della normalizzazione, che è stata corretta. I singoli cluster metabolomici post normalizzati e trasformati sono stati utilizzati per GWAS, producendo in diverse associazioni di marcatori di tratti. Nell'analisi rappresentativa, diverse classi di composti sono evidenziate in diversi colori, mentre i marcatori associati a più classi di composti sono indicati con il suo gene più vicino.
La normalizzazione e la trasformazione dei dati sono uno dei passaggi più importanti. Assicurarsi che sia stata eseguita una correzione adeguata per correggere l'errore sistemico e garantire la normalità nella distribuzione. Eseguendo la correzione per la variazione analitica, è possibile eseguire diversi approcci di integrazione, come l'analisi della correlazione metabolica e l'integrazione in dati fenomici per far luce su tratti complessi.
