חקירת אוכלוסייה גדולה יותר מגיעה עם וריאציה מונחית מכונה, אשר על ידי כך הווריאציה בפועל שמקורה במגוון הטבעי. כאן אנו מדגימים שיטה להפחתת השונות הטכנית לניתוח אינטגרציה במורד הזרם. היתרונות של טכניקה זו כוללים מיצוי מבוסס הפרדת פנים, המספק ניתוח של מטבוליטים שונים על הפלטפורמה האנליטית המתאימה, תוך הסרת השגיאה המערכתית ושמירה על השונות הביולוגית.
לאחר קבלת המידע הגנוטיפי והפנוטיפי, ניתן ליישם שיטה זו על כל אוכלוסייה טבעית מגוונת בכל ממלכת חיים. כדי להתחיל לקחת צינורות קציר של 20 מיליליטר, להוסיף שניים חמישה מילימטר, ושני חרוזי מתכת בקוטר שמונה מילימטר להומוגניזציה ולתייג את הצינורות. לאחר מכן, מלאו דיואר בחנקן נוזלי, מיד לאחר חיתוך דגימות עלים טריים של עלים ורקמות שורש בחנקן נוזלי על ידי הקפאת הבזק.
אחסנו את הדגימות הביולוגיות שנקטפו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס להמשך עיבוד. קירור מראש של מחזיקי הצינורות בחנקן נוזלי. לאחר מכן, לטחון את הרקמות ב 25 הרץ במשך דקה אחת כדי לקבל אבקה הומוגנית.
חוזרים על הקפאה, וטחינה אם הרקמה אינה נטחנת באופן הומוגני. שקלו 50 מיליגרם של חומר צמחי טרי בצינורות מיקרו-צנטריפוג' עם תווית מקוררת מראש עם נעילה בטוחה לשני מילימטרים, המבטיחים שהחומר הצמחי יישאר קפוא במהלך תהליך השקילה. הוסיפו מיליליטר אחד של תערובת מיצוי מקוררת מראש 1 עד 50 מיליגרם אליקווט של הדגימה, וסובבו את הצינור לזמן קצר לפני שהם שומרים על קרח.
דגירה של הדגימות על שייקר מסלולי ב-800 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן sonication באמבט סוניקציה מקורר קרח במשך 10 דקות. השתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 500 מיקרוליטרים של תערובת מיצוי גם לדגימות וערבבו את התמציות על ידי מערבולת קצרה, ואז צנטריפוגה בתערובת ב-11, 200 פעמים G למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, העברת 500 מיקרוליטרים של הפאזה המכילה שומנים עליונים מופרדים לצינור מיקרו-צנטריפוגה עם תווית מוקדמת של 1.5 מיליליטר, הוסרה שאר הפאזה העליונה.
בנפרד, 1.5 מיליליטר בטוח נעילה צינורות microcentrifuge להעביר 150 microliters של פאזה חצי קוטבית תחתונה ארבעה GCMS ו 300 microliters של פאזה חצי קוטבית ארבעה U-H-P-L-C MS ניתוח. השתמשו ברכז ואקום לאידוי ממסים כדי לרכז את כל השברים המופקים ללא חימום ולאחסן את השברים המיובשים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין את הדגימה לביצועים גבוהים במיוחד, כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסות או H-P-L-C MS משעים מחדש את השברים הקוטביים למחצה המיובשים ב-180 מיקרוליטרים של תערובת של מתנול ומים.
לאחר מכן צליל את הפאזה הקוטבית למחצה במשך 2 דקות, ואחריה צנטריפוגה ב 11, 200 פעמים G במשך דקה אחת. לאחר צנטריפוגה, מעבירים 90 מיקרוליטרים של הסופרנאטנט לבקבוקון זכוכית ומזריקים שני מיקרוליטרים של התמציות לתוך דגימת ה-LCMS שנמזגה. בצע את פיצול המטבוליטים בעמודת שלב C18 הפוכה המוחזקת ב-40 מעלות צלזיוס, וזרימה של 400 מיקרוליטרים לדקה עם שינויים הדרגתיים של שפכים A ו-B, רכשו את ספקטרום המסה של דגימות הבדיקה הריקות ובקרת האיכות במצב יינון שלילי עם טווח מסה של 102 1500 מסה ליחס מטען.
עבור דגימות מטבוליטים קוטביים למחצה, הפעל דגימת QC מאוגדת בספקטרומטריית מסות טנדם תלוית נתונים במצבי יינון שליליים וחיוביים. השתמש בספקטרום המסה המתקבל עבור הביאור. בצע את הנורמליזציה של ערכת הנתונים על-ידי בדיקת התפלגות התקן הפנימי.
נרמל את הנתונים על ידי תיקון האות של תקנים פנימיים בודדים או מרובים. לאחר מכן, תקן את עוצמות השיא המתקבלות מהכרומטוגרמה על פני משקל הדגימה המדויק. לתיקון סחף העוצמה על פני סדרות מרובות אצווה, בצע שיטות תיקון מבוססות QC כגון החלקת פיזור משוערת מקומית באמצעות R.לפני ביצוע מחקרי שיוך כלל-גנומיים או GWAS, סנן את הנתונים הגנוטיפיים עבור תדרי אלל קלים הנמוכים מ-5% ושיעור חסר של יותר מ-10% באמצעות ציצית.
זה ימנע הטיה בתדר נמוך. כדי למנוע את ההטיה שמקורה בגורמים הסביבתיים, השתמש בחבילת R LME four וחשב את התחזיות או התחזיות הליניאריות והבלתי משוחדות הטובות ביותר עבור כל תכונה מנורמלת על פני החזרות הניסוייות. השתמש ב-blops של כל תכונה בנפרד כדי לבצע GWAS עם חבילת rMVP ב-R.הנתונים הליפידומיים על פני מספר מיני שעועית נפוצים מוצגים על סמך כרומטוגרמות שיא הבסיס הגולמיות של שתי דגימות QC מאצוות שונות.
שינוי בעוצמות האות נצפתה בשיעורי ליפידים מסוימים. השגיאה המערכתית הייתה ברורה יותר כאשר ניתוח הרכיבים העיקריים בוצע על הנתונים הגולמיים. הליך הנורמליזציה, כולל החלקת הפיזור המוערכת באופן מקומי, הוביל להתקבצות של דגימות ה-QC.
בעת ניתוח לאשכולות הבודדים, שגיאות מונחות מכונה באצווה 7 ו-8 התבררו לפני הנורמליזציה, שתוקנה. האשכולות המטבולומיים האינדיבידואליים המנורמלים והמשתנים שימשו עבור GWAS, והניבו מספר אסוציאציות של סמני תכונות. בניתוח הייצוגי, מחלקות תרכובות שונות מודגשות בצבעים שונים, בעוד שהסמנים הקשורים למחלקות מורכבות מרובות מסומנים עם הגן הקרוב ביותר שלו.
נורמליזציה ושינוי צורה של נתונים הם אחד השלבים החשובים ביותר. ודא שבוצע תיקון תקין כדי לתקן שגיאה מערכתית ולהבטיח נורמליות בהתפלגות. על ידי ביצוע התיקון עבור השונות האנליטית, ניתן לבצע מספר גישות אינטגרציה, כגון ניתוח מתאם מטבולי ואינטגרציה בנתונים פנומיים כדי לשפוך אור על תכונות מורכבות.
