Ce protocole est important car il est simple à réaliser et à la portée de n’importe quel laboratoire. Ce protocole permet l’isolement de peptides HLA ou MHC de type I ou de type II à partir d’échantillons humains ou murins. Cette méthode peut répondre à des questions scientifiques liées à tous les domaines de recherche impliquant le système immunitaire, que ce soit dans le cancer, la virologie ou les maladies auto-immunes.
Ce protocole a été conçu pour être accessible à toute personne travaillant dans un laboratoire de recherche. Il suffit de suivre les étapes. Commencez à activer les billes de bromure de cyanogène sepharose en pesant 80 milligrammes par échantillon et en les transférant dans un tube conique de 15 millilitres.
Ajouter cinq millilitres d’acide chlorhydrique millimolaire. Pipettez de haut en bas cinq fois pour faciliter la remise en suspension des billes séchées, puis remplissez le tube conique avec 8,5 millilitres supplémentaires d’acide chlorhydrique d’un millimolaire. Faites pivoter les billes à 20 tr/min pendant 30 minutes à température ambiante à l’aide d’un rotateur.
Centrifuger les billes à 200x G pendant deux minutes à température ambiante et retirer le surnageant par aspiration. Ajoutez 500 microlitres de tampon de couplage à la palette de perles, puis transférez la suspension de perles dans un nouveau tube de centrifugeuse de deux millilitres et mettez-la de côté. Pour coupler les anticorps à ces billes, ajoutez deux milligrammes de l’anticorps sélectionné dans un nouveau tube de microcentrifugation de deux millilitres et augmentez le volume à un millilitre avec une solution tampon de couplage pour obtenir une concentration finale de deux milligrammes par millilitre.
Transférer la solution de billes préparée précédemment et l’ajouter à la solution d’anticorps. Ensuite, faites pivoter le tube de microcentrifugation à 20 tr / min pendant 120 minutes à l’aide d’un rotateur, centrifugez les billes, puis retirez le surnageant comme décrit précédemment. Maintenant, commencez à bloquer et à laver les billes en ajoutant d’abord un millilitre de glycine 0,2 molaire au tube de microcentrifugation contenant les billes couplées aux anticorps, et en tournant à 20 tr / min pendant 60 minutes à température ambiante à l’aide d’un dispositif de rotateur.
Après avoir centrifugé et retiré le surnageant, lavez les billes avec un millilitre de PBS, retirez le surnageant par centrifugation et conservez les perles dans un millilitre de PBS à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour isoler les peptides de classe I ou II du CMH, décongelez une palette congelée de 100 millions de cellules en réchauffant le fond du tube avec une paume. Ajoutez 500 microlitres de PBS à la palette et pipette de haut en bas jusqu’à ce que la suspension soit homogène.
Transférer la suspension dans un nouveau tube de microcentrifugation de deux millilitres et ajouter un volume égal de tampon de lyse cellulaire. Faites pivoter à 10 tr/min pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’un rotateur. Centrifuger le lysat de la cellule à 18 000 x G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius avec un frein complet et transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de deux millilitres.
Récupérer les billes couplées aux anticorps par centrifugation et enlevant le surnageant. Ensuite, transférez le surnageant de lysat cellulaire aux billes couplées aux anticorps et incubez à 10 tr / min pendant 14 à 18 heures pendant la nuit à quatre degrés Celsius à l’aide d’un rotateur. Le deuxième jour, retirez le couvercle inférieur de la colonne en polypropylène, placez la colonne sur le rack de colonne en polypropylène et installez un récipient vide en dessous pour recueillir le flux.
Maintenant, rincez la colonne de polypropylène avec 10 millilitres de tampon A et laissez-la s’écouler par gravité. Si la vitesse d’écoulement de l’élution liquide est trop lente, coupez davantage l’extrémité inférieure de la colonne en polypropylène. Mesurer et recueillir le mélange perles/lysat et le transférer dans la colonne de polypropylène.
Laissez le mélange liquide éluter par gravité. En option, collectez et congelez 20 microlitres d’aliquote pour le Western blotting. Maintenant, lavez les perles retenues dans la colonne de polypropylène en ajoutant 10 millilitres de tampon A et en les laissant éluer par gravité.
Retirez la colonne de polypropylène du rack et placez-la sur le dessus d’un nouveau tube de microcentrifugation de deux millilitres, en tenant la colonne et le tube ensemble à la main. Ajoutez 300 microlitres de 1% TFA à la colonne de polypropylène et mélangez les perles en les faisant monter et descendre cinq fois. Ensuite, transférez l’éluat dans un nouveau tube de microcentrifugation de deux millilitres.
Pour dessaler et éluer les peptides du CMH, ajouter 200 microlitres de méthanol sur le dessus de la colonne C-18 et centrifuger à 1 546 x G pendant trois minutes pour éliminer le flux. Ajouter 200 microlitres d’acétonitrile à 80 % dans 0,1 % de TFA sur le dessus de la colonne C-18 et centrifuger à nouveau pour éliminer le débit. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 0,1% TFA, en éliminant le flux par centrifugation.
Enfin, chargez 200 microlitres des complexes peptidiques du CMH sur le dessus de la colonne C-18, écartez le flux par centrifugation et répétez jusqu’à ce que le volume complet soit chargé. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 0,1% TFA, centrifugez pour éliminer le flux, transférez la colonne C-18 dans un nouveau tube de microcentrifugation de deux millilitres et éluez les peptides MHC en ajoutant 150 microlitres d’acétonitrile à 28% dans 0,1% TFA. Après centrifugation, recueillir l’écoulement dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.
Répétez le processus d’élution deux fois pour un volume total de 450 microlitres et congelez à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit analysé par LC-MS-MS. Utilisez ces peptides purifiés pour l’identification des peptides de classe I et II du CMH dans un spectromètre de masse. L’efficacité de liaison des billes a été illustrée par une diminution significative de l’intensité de coloration du signal des chaînes légères et lourdes lorsque les perles sont liées de manière covalente aux billes CNBr, par rapport à l’anticorps avant le couplage.
L’isolement des complexes peptidiques du CMH après l’élution acide a été confirmé par le signal de détection fort des complexes peptidiques du CMH à l’aide d’anticorps anti-HAL-ABC à chaîne lourde. La reproductibilité intra et interindividuelle des résultats à l’aide du protocole actuel a également été estimée. Le coefficient de variation moyen du nombre de peptides détectés sur trois répliques biologiques différentes était faible, qui variait de 1,9 à 11%Cependant, l’identité des peptides variait considérablement et la proportion de peptides détectés de manière reproductible sur trois réplicats biologiques variait de 39% à 63%Les cartes thermiques générées montraient la force de liaison prédite du CMH des peptides identifiés.
Pour les peptides de classe I et de classe II du CMH de souris, les liants forts ou faibles prédiqués étaient respectivement de 89 et 87 %. Pour les peptides HLA humains de classe I et de classe II, les liants forts ou faibles prédiqués étaient respectivement de 97 et 70%. Les motifs de liaison peptidique de la souris et de l’homme pour les peptides LHC de classe I et de classe II ont également été générés.
Avant l’optimisation de ce protocole, l’isolement des peptides murins de classe I et II du CMH était assez difficile. Ce protocole optimisé facilitera l’isolement des peptides murins du CMH de classe I et II à partir de modèles murins in vivo, par exemple, couramment utilisés pour la validation de nombreuses études diverses liées à la maladie.
