La masarimycine est l’un des rares inhibiteurs des autolysines bactériennes qui arrête la croissance cellulaire bactérienne. Il peut être utilisé pour étudier les différences entre l’inactivation chimique et génétique des autolysines, et fournit une approche orthogonale de la génétique pour étudier la physiologie bactérienne. La synthèse de la masarimycine peut sembler intimidante.
Suivez attentivement les étapes indiquées. En cas de doute sur le fonctionnement d’une étape de réaction, confirmez par chromatographie sur couche mince et les modifications des valeurs RF. Pour commencer, préparez une solution 0,1 molaire de cyclohexylamine, de cyclohexylcarboxaldéhyde, d’acide ortho-iodobenzoïque et d’isocyanure de cyclohexyle dans du méthanol.
Ajouter la barre d’agitation magnétique, puis mélanger cinq millilitres de cyclohexylamine et cinq millilitres de cyclohexyl carboxaldéhyde dans une fiole à fond rond coiffée et placer la fiole dans un bain de sable sur un agitateur à plaque chauffante pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius. Surveillez la température à l’aide d’un thermomètre placé à environ un centimètre sous la surface du sable. Après 30 minutes, ajouter cinq millilitres d’isocyanure de cyclohexyle à la solution et remuer pendant 20 minutes supplémentaires à 50 degrés Celsius.
Ensuite, ajoutez cinq millilitres d’acide ortho-iodobenzoïque au mélange réactionnel et continuez à remuer à 55 degrés Celsius pendant trois à cinq heures. Après trois heures d’agitation, surveillez périodiquement la progression de la réaction par chromatographie sur couche mince, ou TLC, à des intervalles d’environ une heure. Considérons la réaction comme terminée lorsqu’un seul point avec un facteur de rétention égal à 0,3 est visible sur la plaque TLC.
Retirez le solvant dans l’évaporateur rotatif sous pression réduite. Une fois que tout le méthanol est évaporé, dissoudre le produit brut séché dans 30 millilitres d’acétate d’éthyle et le transférer dans un entonnoir de séparation. Extraire séquentiellement l’acétate d’éthyle avec de l’acide chlorhydrique à une molaire, de l’eau, une solution saturée de bicarbonate de sodium, de l’eau à nouveau et une solution saturée de chlorure de sodium, en éliminant les couches aqueuses à chaque extraction.
Ensuite, retirez la couche d’acétate d’éthyle de l’entonnoir de séparation et collectez-la dans une fiole d’Erlenmeyer. Ajouter une spatule pleine de sulfate de sodium anhydre pour éliminer l’eau résiduelle de l’acétate d’éthyle. Filtrer la solution d’acétate d’éthyle séchée à travers un papier filtre numéro un pour éliminer le sulfate de sodium.
Ensuite, lavez le papier filtre avec une petite quantité d’acétate d’éthyle. La solution d’acétate d’éthyle filtrée a été évaporée à sec sur un évaporateur rotatif sous pression réduite pour obtenir de la masarimycine sous forme d’huile une fois que tout l’acétate d’éthyle est retiré. Dissoudre l’huile de masarimycine dans un à deux millilitres d’une solution d’hexane 9:1 en isopropanol et remuer sur une plaque magnétique jusqu’à ce que le composé entier soit dissous.
Pour purifier la masarimycine dissoute, effectuez une chromatographie flash avec une colonne flash de silice de 12 grammes, en phase normale. Équilibrez la colonne flash avec 10 volumes de colonne de phase mobile avec les instruments réglés à un débit de 15 millilitres par minute. Une fois l’équilibrage terminé, prélever la masarimycine dissoute à l’aide d’une seringue de cinq millilitres.
Connectez la seringue directement au sommet de la colonne flash équilibrée et injectez la solution dans la colonne. Reconnectez la colonne chargée au système de chromatographie flash et lancez l’élution du gradient. Eluter masarimycine de la colonne en utilisant l’élution de gradient à une concentration finale de phase mobile de 10:90 hexane en isopropanol sur 12 volumes de colonne.
Surveillez l’élution de la masarimycine par absorption à 230 et 254 nanomètres. Pour l’étude de morphologie, cultivez bacillus subtilis 11774 sur des plaques de gélose LB à 37 degrés Celsius. Dans toutes les expériences ultérieures, utilisez des cellules de deuxième passage cultivées dans cinq millilitres de bouillon LB jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 1.
Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajouter la masarimycine aux tubes de culture marqués traités à une concentration finale de 3,8 micromoles. Pour les tubes de culture étiquetés témoins, ajouter un volume équivalent de DMSO. Placez les échantillons dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes en agitant à 150 tr / min.
Après 90 minutes, fixez chimiquement les cultures dans un mélange 1:10 de milieux de culture et de tampon de fixation à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utilisez une pipette pour appliquer 10 à 20 microlitres des échantillons chimiquement fixés sur des lames de microscope en verre et les laisser sécher à l’air. Ensuite, fixez à la chaleur les échantillons séchés à l’air en chauffant les lames de verre à l’aide d’un brûleur Bunsen.
Après fixation thermique, tacher les échantillons avec 100 microlitres de bleu de méthylène à 0,1%. Après une incubation de 10 minutes avec la tache, lavez l’excès de colorant avec de l’eau distillée. Ensuite, chauffez doucement les lames colorées à 60 degrés Celsius dans un four pendant 15 à 20 minutes pour amener les cellules à un plan focal commun.
Scellez les échantillons colorés en plaçant un couvercle de microscope sur les cellules colorées. Ensuite, scellez les bords à l’aide de ciment à lame de microscope. Placez la lame de microscope scellée sur la scène du microscope et mettez l’image au point à un grossissement de 100X à l’aide de la microscopie à champ lumineux.
Placez une goutte d’huile d’immersion sur la lame du microscope et mettez le champ de vision au point à l’aide d’un grossissement de 1000X. Acquérir des micrographies à l’aide d’une caméra fixée au microscope et à son logiciel associé. Obtenez des images à l’aide des paramètres de balance des blancs et d’ouverture automatiques du logiciel.
La chromatographie flash permet une purification rapide de la masarimycine avec une grande pureté. L’évaluation de la synergie ou de l’antagonisme avec l’inhibiteur de l’ATPase optochine chez S.pneumoniae est présentée ici. La concentration la plus faible du composé pour inhiber la croissance bactérienne, indiquée par la couleur bleue, est considérée comme la valeur minimale de concentration inhibitrice en présence d’un co-médicament.
En revanche, les puits de couleur rose indiquent une croissance bactérienne. Les essais phénotypiques utilisant la masarimycine à 0,75 fois les concentrations inhibitrices minimales ont démontré un phénotype semblable à celui de la saucisse pour B.subtilis et un phénotype agglutinant pour S.pneumoniae. Faites attention à la température de la réaction.
Assurez-vous que la réaction est complète en surveillant avec TLC. Cette méthode peut être utilisée en conjonction avec des antibiotiques marqués par fluorescence pour étudier les modifications de la paroi cellulaire par microscopie.
