Nous avons mis en place une technologie de plate-forme pour le SRAS COVID 2 qui peut être applicable à d’autres virus avec la reconnaissance cellulaire médiée par Spike et l’entrée comme première étape de l’infection virale cellulaire. Les points quantiques sont brillants, stables et leur surface peut être fonctionnalisée pour une variété d’applications cellulaires. En utilisant cette méthode, nous pouvons visualiser et mesurer l’internalisation de Spike dans les cellules.
Pour préparer 0,1%BSA. Ajouter 130 microlitres de 7,5 % de BSA à 10 millilitres de supports d’imagerie en mélange. Pour une dilution en série de 6,1 à trois et un triple, ajoutez 14,26 microlitres de QD Spike à 285,74 microlitres du 0,1% BSA pour obtenir la concentration la plus élevée de 20 nanomoles.
Ajoutez ensuite 100 microlitres de 20 nanomoles ou QD Spike à 200 microlitres de 0,1% BSA pour faire la deuxième illusion de 6,67 nanomoles QD Spike. Retirez tous les supports usés de chaque puits à l’aide d’un aspirateur multicanal, lavez une fois avec une pipette multicanal avec 100 microlitres de supports d’imagerie par puits, puis aspirez 100 microlitres du support d’imagerie. Ajoutez 50 microlitres de solution QD Spike par puits et incubez la plaque pendant trois heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
En portant un équipement de protection, préparez des supports d’imagerie à 4 % de PFA et 0,1 % de PSA à l’intérieur d’une armoire de biosécurité stérile, aspirez 50 microlitres de QD Spike de chaque puits et ajoutez 100 microlitres de 4 % de PFA par puits avec une pipette multicanal automatisée pour éviter de sécher les puits. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante, puis laver trois fois avec du PBS, préparer le colorant nucléaire rouge foncé en diluant la solution mère de cinq millimètres à un à 1000 dans du PBS, aspirer le PBS et ajouter 50 microlitres de colorant nucléaire dilué par puits. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante puis laver trois fois avec du PBS, imager la plaque ou la sceller à l’aide d’un scellant à plaques pour l’imagerie ultérieure.
Conservez la plaque à quatre degrés Celsius. Démarrez le logiciel de la plate-forme d’imagerie. Après avoir connecté à la plate-forme d’imagerie, créez un nouveau protocole d’acquisition en sélectionnant le type de plaque comme plaque d’imagerie inférieure transparente à 96 parois, sélectionnez le mode optique est devenu focal et le grossissement comme 40 fois l’immersion dans l’eau, sélectionnez le binning comme un.
Sélectionnez le mode de contraste numérique du visage, tel qu’un contraste élevé, pour produire des corps cellulaires bien définis. Prenez un instantané pour confirmer que ce titre est approprié comme indiqué dans la fenêtre d’image, sélectionnez le canal C approprié à utiliser avec la lignée cellulaire ACE2-GFP pour visualiser le trafic ACE2 dans la cellule. Pour créer un canal QD personnalisé, sélectionnez le menu déroulant triangle et choisissez l’excitation dans la plage de 405 nanomètres en émission dans la gamme de 608 nanomètres, sélectionnez un puits avec un signal QD cytoplasmique robuste pour régler le temps d’exposition, la puissance laser et la position de hauteur Z.
Vérifiez si la hauteur par défaut produit une image des cellules dans le plan focal souhaité. La position Z sera plus basse pour l’endocytose puncta que la position Z pour la membrane plasmique. Choisissez un temps d’exposition, généralement compris entre 100 et 300 millisecondes, qui produit une image lumineuse avec des niveaux de gris, au moins trois fois supérieurs au signal d’arrière-plan.
À 20 nanomoles, les niveaux de gris devraient être d’environ 6 000 unités atomiques avec un temps d’exposition de 200 millisecondes et une puissance laser de 80%. Vérifiez les niveaux de gris en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’image produite avec la fonction d’instantané dans chaque canal et en sélectionnant afficher l’intensité, puis cliquez avec le bouton gauche sur l’objet d’intérêt ou l’arrière-plan pour afficher le niveau de gris de ce pixel, ajustez la puissance laser pour affiner l’intensité des objets d’intérêt. Enregistrez le protocole d’acquisition, basculez pour exécuter l’expérience et entrez le nom de la plaque, exécutez l’expérience.
La translocation des QD et de l’ACE2 a été visualisée à l’aide de la microscopie à fluorescence et d’une lignée cellulaire exprimant ACE2-GFP. La segmentation de l’image et l’analyse ultérieure ont été effectuées pour extraire les paramètres pertinents tels que le nombre de points. Tout d’abord, les noyaux ont été segmentés à partir du canal marqueur nucléaire pour créer une population de retour sur investissement.
Ensuite, une région roi décrivant la cellule avec segmenté à l’aide du canal ACE2-GFP. Enfin, les points de pointe QD 608 ont été segmentés à partir de la région roi cellulaire, les signaux QD et ACE2 internalisés ont montré une forte colocalisation. Une expérience de réponse de concentration avec six concentrations différentes de QD Spike a été réalisée dans des cellules HEK 293T.
En déterminant les concentrations optiques de QD, QDS peut être utilisé aussi bas que 2,22 nanomoles, cependant, il est recommandé d’utiliser des concentrations de 10 nanomole ou plus pour assurer une réponse robuste. Au cours de la conjugaison avec l’agrégation de la protéine QD peut se produire. Des agrégats ont été repérés dans la solution QD sous forme de précipités agglomérés brillants et de cellules HEK 293T, les QD ont été incubés avec des anticorps neutralisés à partir de 30 microgrammes par microlitre avant l’ajout aux cellules, ces anticorps ont bloqué l’internalisation de la liaison et ont entraîné une réduction du nombre de points par rapport aux cellules traitées avec QD uniquement.
Cet essai peut également être utilisé pour le dépistage à haut débit, l’évaluation principale des anticorps neutralisants afin d’identifier les antiviraux de jeu de mots à l’entrée virale de bloc et être adapté pour étudier les nouvelles variantes émergentes.
