The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.

1. Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Nettoyage lamelle REMARQUE: Travailler sous une hotte. <ol><li> Utiliser des pinces propres à placer des lamelles de verre (diamètre 24 mm) dans un support de lamelle qui sépare les lamelles individuelles. </li><li> Placer le support à lamelles dans un bécher, et ajouter le chloroforme jusqu&#39;à ce que les lamelles sont couverts. Recouvrir de papier d&#39;aluminium pour réduire l&#39;évaporation et de traitement par ultrasons dans un bain sonique pendant 1 heure à température ambiante. Retirez le support de la lamelle sur le bécher et laisser les lamelles sec. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.1.2 avec une solution de NaOH 5M au lieu de chloroforme. </li><li> Retirez le support de la lamelle dans un nouveau récipient et laver trois fois avec de l&#39;eau distillée. Mettre lamelles nettoyées dans une plaque de culture de cellules en verre rempli d&#39;éthanol à 100%. </li></ol></li><li> Préparation d&#39;échantillons d&#39;étalonnage <ol><li> Dissoudre colorant fluorescent dans un solvant approprié. </li><li> Préparer une dilution en série de 1:10 le colorant fluorescent allantà partir de 13 heures à 1 nM dans stérilisé par filtration (0,22 um) de l&#39;eau. </li><li> Prenez lamelles nettoyées stockées dans 100% d&#39;éthanol et laver avec de l&#39;eau stérilisée par filtration. Coin 20 ul de chaque dilution de colorant fluorescent sur une lamelle couvre-objet nettoyé séparément. Laissez sécher les lamelles sous une hotte stérile. Protéger les lamelles de la lumière et de la poussière jusqu&#39;à utilisation. Utiliser ces échantillons pour estimer l&#39;intensité de molécules fluorescentes à simple (voir l&#39;étape 3). </li></ol></li><li> Transfection <ol><li> Culture de cellules CHO dans du milieu Eagle modifié 1:01 / mélange nutritif de Dulbecco F-12 (DMEM/F12) additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine à 37 ° C, dans . 5% de CO 2 NOTE: Utiliser les médias libres phénol rouge tout au long de l&#39;expérience afin de minimiser autofluorescence. </li><li> Prenez lamelles nettoyées de la solution d&#39;éthanol à 100%, les laver avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS), et placer une lamelle dans chaque puits d&#39;une culture pl 6 cellules de bienmangé. </li><li> Trypsiniser, et compter des cellules CHO de la graine à une densité de 3 x 10 5 cellules / puits dans la plaque de culture cellulaire à 6 puits contenant des lamelles couvre-objet. Laisser les cellules se développent dans un incubateur (37 ° C, 5% CO2) pendant 24 heures afin de parvenir à env. 80% de confluence, ce qui est de la densité cellulaire optimale pour la transfection. </li><li> Pour chaque puits, diluer 2 pg de l&#39;ADN de plasmide désiré (par ex., SNAP-marqué récepteur β 2-adrénergique), et 6 ul de Lipofectamine 2000 dans deux tubes séparés contenant 500 ul de milieu OptiMem. Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Combiner les solutions de l&#39;étape 1.3.4 dans un tube et mélanger pour obtenir un mélange de transfection. Faire incuber le mélange de transfection à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Au cours de l&#39;incubation (1.3.5), prendre les cellules CHO et laver deux fois avec préchauffé (37 ° C) PBS. Remplacer PBS avec 1 ml / puits de milieu de phénol DMEM/F12 dépourvu de rouge de supplémenté avec 10% de FBS, mais sans antibiotiques. </li><li> Ajouter l&#39;ensemble transfectmélange d&#39;ions (1 ml) de l&#39;étape 1.3.5 goutte à goutte à chaque puits, et doucement basculer la plaque arrière pour assurer un mélange complet. </li><li> Incuber pendant 2 à 4 heures à 37 ° C, sous 5% de CO 2 et de passer immédiatement après à l&#39;étape suivante. REMARQUE: Ces conditions de transfection ont été optimisés pour obtenir des densités des récepteurs &lt;0,45 particule / um 2, qui sont adaptés pour une seule Imagerie molécule. Ajustements pourraient être nécessaires lors de l&#39;utilisation de cellules différentes, des constructions ou des réactifs. </li></ol></li><li> l&#39;étiquetage de protéines <ol><li> Diluer 1 ul de fluorophore-BG solution stock dans 1 ml de milieu DMEM/F12 supplémenté avec 10% de FBS pour obtenir une concentration finale de 1 uM. Prenez les cellules transfectées de l&#39;incubateur et laver deux fois avec préchauffé (37 ° C) PBS. Remplacer PBS avec 1 ml de solution fluorophore BG-1 uM et incuber pendant 20 min à 37 ° C 5% de CO2 dans un incubateur. </li><li> Après l&#39;incubation, laver les cellules de troisfois avec du milieu DMEM/F12 additionné de 10% de FBS, à chaque fois suivies de 5 minutes d&#39;incubation à 37 ° C. Prenez une lamelle (avec cellules marquées) avec des pincettes et le placer dans une chambre de l&#39;imagerie. </li><li> Laver deux fois avec 300 tampon d&#39;imagerie ul. Ajouter 300 pi de tampon d&#39;imagerie frais et procéder immédiatement à l&#39;imagerie (Partie 2). </li></ol></li></ol> 2. L&#39;acquisition d&#39;images REMARQUE: Utilisez une réflexion interne totale fluorescence (FRBR) de microscope, équipé d&#39;un objectif à immersion d&#39;huile à grande ouverture numérique (par exemple, ouverture numérique magnification/1.46 100X.), Lasers appropriés (par exemple, 405 nm, 488 nm, 561 nm et 645 lasers à diode nm), un dispositif à couplage de charge de multiplication d&#39;électrons (EMCCD) de la caméra, un incubateur et un contrôle de la température de visualiser des molécules fluorescentes simples. <ol><li> Réglez les paramètres du microscope souhaités, soit., Ligne de laser, l&#39;angle de la FRBR (ce paramètre contrôle la pénétrationprofondeur tion du champ évanescent), temps d&#39;exposition, le taux et le nombre d&#39;images par film de 10 châssis. Gardez l&#39;appareil de chauffage / incubateur et contrôle de la température toujours à éviter les dérives de température et l&#39;humidité de condensation. </li><li> Mettre une goutte d&#39;huile d&#39;immersion sur l&#39;objectif du microscope 100X. Placer la chambre de formation d&#39;image avec les cellules marquées sur le porte-échantillon du microscope, et d&#39;amener les cellules à se concentrer en utilisant un éclairage en fond clair. </li><li> Passez à l&#39;éclairage de la FRBR. Maintenir la puissance aussi faible que possible pour permettre au laser de chercher la cellule souhaitée, mais en même temps de minimiser photoblanchiment. </li><li> Sélectionnez la cellule désirée et bien la mise au point. Régler la puissance du laser à un niveau qui permet la visualisation des fluorophores uniques. Acquérir une séquence d&#39;images et enregistrer le fichier brut de séquence d&#39;image. Tiff. </li></ol> 3. Calibration (fluorophores simples sur monomères / Contrôle de récepteurs dimères verre et) <ol><li> Assemblez chaque sampl d&#39;étalonnagee préparé comme décrit en 1.2 dans la chambre d&#39;imagerie. Placez chaque échantillon sur le microscope et choisir l&#39;échantillon contenant des taches de diffraction limitée bien séparées l&#39;eau de Javel en une seule étape. REMARQUE: Ces points représentent des molécules simples de colorant fluorescent. </li><li> Acquérir FRBR séquences d&#39;images comme décrit à l&#39;étape 2. Important: les mêmes paramètres d&#39;imagerie doivent être utilisés pour toutes les expériences, y compris ceux pour le calibrage. </li><li> Effectuer la détection et l&#39;analyse de suivi tel que décrit dans 4.1 au 4.2. Extraire l&#39;intensité de chaque particule comme décrit dans 4.2.6. A partir de ces données, calculer la moyenne (μ) et l&#39;écart type (σ) de l&#39;intensité des fluorophores uniques. </li><li> Facultatif: effectuer la même analyse sur les cellules transfectées avec un récepteur de surface cellulaire monomère (. Par exemple, CD86), N-terminale étiqueté avec un ou deux exemplaires de SNAP 10 et étiqueté avec le dérivé fluorophore BG. Follow la procédure décrite ci-dessus pour le fluorophore unique sur le verre. Estimer l&#39;efficacité de marquage tel que décrit dans Calebiro, D. et al. Dix </li></ol> 4. Analyse de l&#39;image <ol><li> préparation de la séquence de l&#39;image <ol><li> Utilisez un logiciel de traitement d&#39;image (par exemple., ImageJ) à recadrer les images. </li><li> Enregistrer des images individuelles séparées. Des images TIFF dans un nouveau dossier, en indiquant sur ​​chaque image le numéro de châssis. </li><li> Mesurer l&#39;aire de surface de la cellule en établissant une région d&#39;intérêt (ROI) le long du contour d&#39;une cellule et en utilisant l&#39;outil de mesure dans ImageJ ou un outil similaire dans un autre logiciel. Utiliser cette valeur pour calculer la densité des particules en divisant le nombre total de particules au début du film de la zone de surface de la cellule. </li></ol></li><li> détection de particules et de suivi REMARQUE: Utilisez un logiciel non commercial tel que u-piste 13, travaillant dans Matlabenvironnement, de détecter automatiquement et de suivre les particules de récepteurs simples. NOTE: L&#39;algorithme u-piste est basée sur l&#39;approche de suivi multi-hypothèse. Cette approche relie les particules entre les images par la construction des matrices de coûts, où les probabilités individuelles qu&#39;une particule donnée dans un cadre correspond à une particule donnée dans la trame suivante, apparaît, disparaît ou se confond / divise avec / par les autres particules sont affectés. La solution qui minimise les coûts à l&#39;échelle mondiale, à savoir., L&#39;une avec la plus grande probabilité, est finalement sélectionné. Cela permet également de suivre une particule disparaître temporairement, un phénomène typique causé par fluorophore clignotant. La dernière version de u-piste (2.1.0) a des interfaces utilisateurs graphiques qui facilitent l&#39;exécution de ces analyses. <ol><li> De l&#39;invite de commande Matlab, tapez &quot;movieSelectorGUI&quot; pour ouvrir l&#39;interface de sélection de film. Suivez les instructions pour créer unnouvelle base de données de film à partir des images enregistrées précédemment distincts (voir 4.1.2). </li><li> Fournir la taille de pixel en nm, l&#39;intervalle de temps en secondes, ouverture numérique, la résolution de la caméra et la longueur d&#39;onde d&#39;émission du fluorophore, nécessaire pour la détection et le suivi des particules. Enregistrer la base de données de film. </li><li> Dans l&#39;interface de sélection de films, lancer l&#39;analyse, le choix &quot;simples particules&quot; comme type d&#39;objets. Une nouvelle fenêtre apparaît où les paramètres utilisés pour la détection de particules et le suivi peuvent être définis. Commencer avec les paramètres par défaut. Plus tard, ajuster ces paramètres si la qualité de la détection et / ou de suivi n&#39;est pas satisfaisante (par exemple, certaines particules ne sont pas détectés ou titres sont fragmentés) en option:. Dans les paramètres de suivi, consultez &quot;le suivi des résultats à l&#39;exportation au format matrice&quot; pour stocker les coordonnées et les amplitudes de toutes les particules dans une matrice unique (domaine dit &quot;trackedFeaturedInfo»). Pour une description détaillée de ces paramètres, reportez-vous à la documentation u-piste. </li><li> Exécuter l&#39;algorithme de détection. Cet algorithme déterminer automatiquement l&#39;emplacement et de l&#39;intensité au-dessus de fond de chaque point à diffraction limitée (, complexes ie. Récepteurs uniques / récepteurs) de montage d&#39;une fonction gaussienne bidimensionnelle avec un écart type égal à la fonction d&#39;étalement de point du microscope autour des maxima d&#39;intensité locale . Ensuite, exécutez l&#39;algorithme de suivi. Stocker les résultats des analyses dans un fichier de tapis.. </li><li> Utilisez la routine &quot;movieViewer&quot;, contenue dans le paquet u-piste, ou la coutume ceux semblables à visualiser les pistes et de vérifier la qualité de la détection et de suivi. </li><li> Ouvrez le fichier de tapis. Pour voir la position et l&#39;amplitude (c&#39;est à dire., Intensité) des particules suivis à chaque trame. Les données générées à l&#39;étape 4.2.4 sont contenues dans le domaine de l&#39;ar tracksCoordAmpCG tracksFinalrayon et / ou dans trackedFeaturedInfo. A partir du nombre total de particules détectées calculer la densité des particules en divisant cette valeur par la surface de la cellule mesurée à 4.1.3. </li><li> Facultatif: Utilisez coordonne la particule au cours du temps (voir 4.2.6) pour analyser le mouvement des particules de récepteurs. Calculer les déplacements moyennes carrés (TMS) et les coefficients de diffusion (D) à l&#39;aide de Matlab ou un logiciel similaire. Pour chaque particule, et chaque intervalle de temps (Δ t) considéré, de calculer le déplacement quadratique moyen (MSD) à l&#39;aide de la formule suivante: <img align="middle" alt="Equation 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg" /> où Δ t est l&#39;intervalle de temps dans des trames, N est le nombre de pas analysés, x et y sont de x et y les coordonnées de la particule à la trame indiquée par l&#39;index. Utilisez le MSD sur des parcelles de temps pour évaluer le type de mouvement d&#39;une particule donnée: relations linéairesindiquer diffusion libre (c&#39;est à dire., mouvement brownien), une courbure positive (., la courbe ressemble à une parabole) suggère le mouvement dirigé, une courbure négative est indicative de mouvement limitée 14. Dans le cas de particules diffusant librement, de calculer le coefficient de diffusion (D) de chacune des particules en ajustant les données de TMS obtenues avec l&#39;équation suivante: <img align="middle" alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg" /></li></ol></li><li> Calcul de la taille des particules avec méthode d&#39;ajustement gaussien Remarque: Une fois que la distribution d&#39;intensité d&#39;échantillons d&#39;étalonnage (fluorophores simples sur le verre et / ou des récepteurs monomères marqués par fluorescence), est connu, effectuer un ajustement gaussien mixte sur la distribution des intensités de particules au début d&#39;une séquence d&#39;image pour déterminer la taille des complexes de récepteurs (c.-à-., le nombre de récepteurs par particule) 10. Réaliser ces analyses sous Matlab ou slogiciel es mesures analogues. <ol><li> Calculer l&#39;intensité de chacune des particules en faisant la moyenne de l&#39;intensité de la particule à partir de la première trame de la trame avant le premier changement d&#39;intensité s&#39;est produite (dans la plupart des cas en raison d&#39;une diminution de photoblanchiment). </li><li> De réaliser un ajustement gaussien mixte selon l&#39;équation suivante: <img align="middle" alt="Equation 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg" /> où φ (i) est la fréquence des particules ayant une intensité i, n est le nombre de composants, α n est un paramètre qui contribue à la hauteur de la composante n, μ et σ sont la moyenne et l&#39;écart-type de l&#39;intensité de référence fluorophores simples . (calculé tel que décrit à l&#39;étape 3) NOTE: Déterminer til nombre maximal d&#39;éléments (n max) pour chaque séquence d&#39;image en augmentant progressivement n max jusqu&#39;à ce que l&#39;ajout d&#39;un composant ne produit plus un meilleur ajustement statistique, tel que jugé par un F-test. </li><li> Facultatif: (. Par exemple, les 60 dernières images d&#39;une séquence d&#39;images 400) Effectuer un ajustement gaussien mixte sur la distribution d&#39;intensité obtenu sur les dernières images du film. Remplacer μ et σ avec les valeurs obtenues après cette mise en place, qui fournissent des estimations plus précises de ces paramètres, et répétez l&#39;étape 4.3.2. </li><li> Calculer l&#39;aire sous la courbe (AUC) de chaque composante de l&#39;ajustement gaussien mixte. Calculer l&#39;abondance relative de particules de récepteur de taille différente (par exemple, un monomère, dimère, trimère, etc) en divisant la valeur AUC de chaque composant par l&#39;AUC de l&#39;ensemble de distribution. </li><li>Facultatif: Utiliser les données de différentes cellules et les densités de particules correspondantes (calculées comme décrit au point 4.2.6) pour générer des parcelles où la distribution des particules de taille différente est corrélée avec la densité de particules 10. </li></ol></li><li> Calcul de la taille des particules du corps avec l&#39;étape procédé REMARQUE: Utiliser une analyse montage étape comme une méthode alternative pour déterminer la taille de complexes de récepteurs 10. La base de cette analyse est que la destruction provoquée par la lumière (photo-blanchiment) d&#39;un seul des résultats fluorophores dans sa disparition instantanée - ainsi des particules contenant n fluorophores devraient progressivement l&#39;eau de Javel produire un profil d&#39;intensité à n étapes. <ol><li> Extrait profils d&#39;intensité de chaque particule à partir du fichier de tapis. Généré par u-piste ou un logiciel de détection / suivi similaire (voir 4.2.6). </li><li> Utiliser un algorithme d&#39;ajustement étape, tel que celui présentédans la réf. 10, pour compter le nombre d&#39;étapes de blanchiment pour chaque particule. </li><li> En option: utiliser les résultats pour générer des distributions montrant l&#39;abondance relative des particules de récepteurs de différentes tailles et les mettre en corrélation avec la densité de particules comme décrit précédemment pour les résultats de l&#39;ajustement gaussien mixte (voir 4.3). </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Le protocole décrit permet l&#39;analyse de l&#39;agencement spatial, la mobilité et la taille des complexes de récepteurs de surface cellulaire au niveau d&#39;une seule molécule. Par rapport à l&#39;utilisation de protéines fluorescentes, le marquage avec de petites fluorophores organiques, qui sont plus lumineux et plus photostable, a l&#39;avantage de permettre une visualisation étendue de particules de récepteurs individuels. Etant donné que les niveaux d&#39;expression obtenus sont extrêmement faibles (&...

Des récepteurs situés à la surface des cellules détectent l&#39;environnement extracellulaire et de répondre à une variété de stimuli, tels que des agents odorants, des ions, des neurotransmetteurs petites et de grandes hormones protéiques. La nature du fluide des membranes cellulaires permet des mouvements de récepteurs et d&#39;autres protéines membranaires. Ceci est essentiel pour la formation de complexes de protéines et la survenue d&#39;interactions protéine-protéine transitoires, telles que celles utilisées par les récepteurs de s&#39;assembler en des unités fonctionnelles et la transduction de signaux à l&#39;intérieur de la cellule. Par exemple, G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG), qui constituent la plus grande famille de récepteurs de surface cellulaire 1, ont été proposées pour former di-/oligomers, ce qui semble être impliquée dans la régulation de fine de la transduction du signal et pourrait avoir des conséquences physiologiques et pharmacologiques importantes 2-5. Microscopie seule molécule a le grand potentiel de visualiser directement avec grande spatiotemprésolution par voie orale le comportement dynamique de récepteurs individuels situés sur la surface de cellules vivantes, y compris leur association pour former des dimères et des complexes moléculaires d&#39;ordre supérieur 10.6. Cette offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes biochimiques et de microscopie standard, qui relèvent habituellement le comportement moyen des milliers ou des millions de molécules. étiquetage des protéines avec un fluorophore suffisamment lumineux et photostable est essentiel pour la microscopie de molécule unique. Ce protocole prend avantage de l&#39;étiquette SNAP récemment introduit 11 à fixer de façon covalente les petites et les fluorophores organiques lumineuses à des récepteurs de surface cellulaire. SNAP est une étiquette 20 kD de la protéine dérivée de la réparation de l&#39;ADN enzyme O 6-alkylguanine-ADN alkyltransférase humaine, qui peut être irréversiblement marqué avec un fluorophore conjugué benzylguanine des dérivés (fluorophore-BG). CLIP, un tag en outre conçu dérivé de SNAP, peut être à la place marquée avec un fluorophore cles dérivés de benzylcytosine onjugated 12. Le protocole rapporté dans ce manuscrit explique comment transfecter et étiquette SNAP-étiqueté 11 récepteurs avec des petits fluorophores organiques et l&#39;utilisation totale de fluorescence à réflexion interne (FRBR) de microscopie pour visualiser les récepteurs simples ou complexes de récepteurs à la surface des cellules vivantes 10. Les résultats de protocole signalés dans&gt; 90% d&#39;efficacité de l&#39;étiquetage d&#39;un SNAP-protéine marquée extracellulaire à la surface cellulaire 10. De plus amples informations sur la manière d&#39;utiliser les données d&#39;une seule molécule à analyser la taille et la mobilité des complexes de récepteurs, ainsi que pour capturer des interactions récepteur-récepteur transitoire, il est prévu. Un flux de travail schématique de l&#39;ensemble du protocole est donné dans la figure 1. A titre d&#39;exemple, la transfection de cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) avec G-récepteurs couplés aux protéines SNAP-tag (RCPG) suivie par marquage avec un dérivé fluorophore BG que ainsi que son application à QUANTIFy et moniteur récepteur di-/oligomerization sont décrits. Ce protocole peut être étendu à d&#39;autres protéines de surface cellulaire et des marqueurs fluorescents (par exemple., CLIP), ainsi que d&#39;autres méthodes de transfection et d&#39;étiquetage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:259px;">Chloroform</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1585</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">NaOH</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S8045</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: strong base and highly corrosive reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">32205</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Glass coverslip&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:115px;">111640</td>
			<td style="width:261px;">24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.2 mm sterile filter</td>
			<td style="width:248px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:115px;">83.1826.001</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CHO cells</td>
			<td style="width:248px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:115px;">ATCC CCL-61</td>
			<td style="width:261px;">Chinese hamster ovary cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well cell culture plare</td>
			<td style="width:248px;">Nunc</td>
			<td style="width:115px;">140675</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:248px;">GIBCO, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11039-021</td>
			<td style="width:261px;">Phenol-red free medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Biochrom</td>
			<td style="width:115px;">S 0115</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Penicillin - streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P06-07 100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P10-23100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11668-019</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">31985-047</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorophore-conjugated benzylguanine&#160;</td>
			<td style="width:248px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:115px;">S9136S</td>
			<td style="width:261px;">SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMSO</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1584</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:259px;">Imaging buffer:</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; NaCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1371</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; KCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3582</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; CaCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A2303</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; MgCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3618</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; HEPES</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3724</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">Imaging chamber</td>
			<td style="width:248px;">Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">A-7816</td>
			<td style="width:261px;">Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF-M</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Model: DMI6000B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF objective</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">11 506 249&#160;</td>
			<td style="width:261px;">HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">EM-CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Photometrics Cascade 512B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:248px;">Pecon</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Tempcontrol 37-2 digital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:248px;">NIH, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">u-track software</td>
			<td style="width:248px;">Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Matlab software</td>
			<td style="width:248px;">The MathWorks, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution spatiotemporal analysis of receptor dynamics by single-molecule fluorescence microscopy

Microscopie de molécule unique est en train de devenir une approche puissante pour analyser le comportement de molécules de signalisation, en particulier concernant les aspects (par exemple., La cinétique, la coexistence de différents états et des populations, des interactions transitoires), qui sont généralement cachés dans des mesures d&#39;ensemble, tels que celles obtenues avec des procédés biochimiques ou microscopie standard. Ainsi, les événements dynamiques, tels que les interactions récepteur-récepteur, peuvent être suivies en temps réel dans une cellule vivante avec une résolution spatio-temporelle élevée. Ce protocole décrit une méthode basée sur l&#39;étiquetage de petites et lumineuses fluorophores organiques et totale de fluorescence à réflexion interne (FRBR) de microscopie pour visualiser directement les récepteurs simples sur la surface de cellules vivantes. Cette approche permet de localiser précisément des récepteurs, de mesurer la taille de complexes de récepteurs, et capturer les événements dynamiques tels que les interactions récepteur-récepteur transitoire. Le protocole fournit une description détaillée de la façon de perform une expérience unique molécule, y compris la préparation de l&#39;échantillon, l&#39;acquisition de l&#39;image et l&#39;analyse d&#39;image. A titre d&#39;exemple, l&#39;application de cette méthode pour analyser deux G-récepteurs couplés aux protéines, c&#39;est à dire., Β 2-adrénergiques et γ-aminobutyrique de type acide B (GABA B) récepteur, est rapporté. Le protocole peut être adapté à d&#39;autres protéines de membrane et des modèles de cellules différentes, les méthodes de transfection et les stratégies de marquage.

Le protocole décrit peut être appliqué à une variété de différentes protéines membranaires. A titre d&#39;exemple, des résultats représentatifs obtenus avec β 2-adrénergiques et GABA B sont rapportés 10. Comme les signaux fluorescents à partir de molécules simples sont faibles, la minimisation de la fluorescence de fond est la première étape clé de bons résultats. Ainsi, il est important d&#39;utiliser des lamelles couvre largement nettoyées (Figure 2A),</stro...

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High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

high-resolution-spatiotemporal-analysis-receptor-dynamics-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K vues.  University of Würzburg, Germany. This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins. 

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

High Resolution Imaging 3D des Ex-Vivo Échantillons biologiques par Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Recherche

Bio-ingénierie

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingénierie « Golden » Fluorescence par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques et analyse des protéines par spectrométrie de masse et de Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...