Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine du trafic de protéines au sujet de la translocation nucléaire et cytoplasmique dans le système dans lequel l’imagerie lumineuse n’est pas disponible. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être appliquée comme protocole général pour l’étude du mouvement des protéines temporelles sans impliquer l’imagerie lumineuse. 20 à 24 heures avant la graine d’infection virale 5 fois 10 à 4 cellules embryonnaires humaines de souffle de poumon ou de fibre de HEL par puits sur une glissière décalée de quatre puits de 11 millimètres et milieu de croissance pour l’incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone.
Il est important de bien faire basculer la toboggan pour assurer une distribution uniforme des cellules tout en prenant soin d’éviter de renverser le milieu de culture. Le lendemain, remplacez les supernatants de sorte que les cultures confluent de 70 à 80 pour cent avec moyen 199, contenant 410 unités de formation de plaque par cellule, et placez la glissade à 37 degrés Celsius avec secousses, pendant une heure. À la fin de l’incubation, remplacer les supernatants par un milieu de croissance frais et retourner les cellules à l’incubateur pour la période d’infection expérimentale appropriée.
Pour la coloration immunofluorescente des cellules infectées par le virus, lavez rapidement les cellules trois fois avec PBS. Suivi d’une incubation de huit à dix minutes dans 200 microlitres de quatre pour cent de paraformaldéhyde dans PBS par puits. À la fin de la fixation, laver les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS par lavage, et perméabiliser les cellules avec 100 microlitres de 0,2 pour cent de surfactant non ionique par puits pendant cinq à dix minutes.
Lavez les cellules perméabilisées trois fois dans PBS comme démontré, et ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage à chaque puits pour une incubation d’une heure à température ambiante. Ensuite, ajoutez la concentration appropriée de l’anticorps primaire d’intérêt à chaque puits pour une incubation à température ambiante de deux heures. À la fin de l’incubation, retirer tout anticorps primaire non lié avec trois lavages de dix minutes dans un tampon de blocage frais et ajouter un anticorps secondaire approprié à chaque puits pour une incubation d’une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière.
À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois dans un tampon de blocage tel que démontré, suivi d’un lavage dans PBS et ajouter une goutte d’antifade montage moyen complété par DAPI à chaque puits. Ensuite, placez un glissement de couvercle sur la glissière et sceller la pente de couverture avec du vernis à ongles transparent. L’application d’une pression douce lors du montage du bordereau de couverture éliminera tout milieu de montage excédentaire, ce qui aidera à assurer l’acquisition d’images de haute qualité.
Pour l’imagerie confocale des cellules infectées étiquetées, sélectionnez les longueurs d’onde secondaires appropriées d’anticorps et de DAPI, et réglez le format d’image à 1 024 par 1 024 pixels avec une ligne moyenne de huit. Puis l’image de chaque puits sur la diapositive de quatre puits sous l’objectif 100x. Pour compter un grand nombre de cellules, obtenir cinq à dix images de champs consécutifs dans le même puits sous l’objectif 40x.
Pour analyser la distribution nucléaire et cytoplasmique d’ICP0, ouvrez le projet dans le logiciel d’application confocal et sélectionnez une image. Ouvrez l’onglet Quantité et sélectionnez Trier les régions d’intérêt dans le menu Outils. Sélectionnez Draw Line et tracez une ligne longitudinale à travers la cellule à analyser.
Un histogramme apparaîtra montrant l’intensité de fluorescence le long de la ligne pour la protéine d’intérêt, et DAPI. Sur la base de la coloration de fond, mettre en place un seuil constant pour l’intensité de la protéine d’intérêt pour l’analyse de la distribution sous-cellulaire de la protéine dans chaque expérience. Si le signal protéique, en moyenne, est inférieur au seuil dans la région nucléaire, mais qu’il dépasse le seuil au-delà de la limite du DAPI, classez le signal protéique comme étant principalement situé dans le cytoplasme.
Si le signal protéique est au-dessus du seuil dans tout le noyau, et au-delà de la limite du signal DAPI, regroupez le signal protéique comme noyau plus localisation cytoplasmique. Si le signal protéique est au-dessus du seuil dans le noyau, mais est en moyenne en dessous du seuil en dehors de la limite du groupe de signal DAPI le signal protéique comme une localisation nucléaire. Enfin, compilez plus de 200 cellules infectées de chaque échantillon à différents points de temps d’infection et tracez les données dans un graphique à barres pour illustrer le mouvement de la protéine d’intérêt au fil du temps.
Comme démontré, cette méthode facilite l’analyse de la translocation nucléaire à cytoplasmique des protéines d’intérêt. Par exemple, la protéine cellulaire infectée zéro, ou la distribution subcellulaire ICP0 change à mesure qu’une infection virale progresse. Pour comprendre les éléments nécessaires au trafic de l’ICP0 pendant l’infection, les mouvements de l’ICP0 peuvent être suivis dans les cellules infectées par le virus Simplex de type Sauvage et Mutant Type Herpès 1 à différentes phases d’infection, permettant l’évaluation de la distribution sous-cellulaire de l’ICP0 à différents moments de l’infection.
Il est important de se rappeler d’utiliser des cultures monocouches afin que les virions aient un accès égal aux cellules et normalisent la multiplicité de l’infection selon le titre du virus afin que la progression de l’infection soit comparable entre et à l’intérieur des virus. Après chaque développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines de la biologie et de la virologie cellulaire pour explorer le mouvement des protéines en étudiant les localisations subcellulaires temporelles des protéines d’intérêt au sein d’une population cellulaire.
