Cet examen a été soutenue par les Instituts nationaux de subventions de la santé, AI074420-02, le Prix Burroughs Wellcome chercheur, bourses de carrière Hirschl à BKC et par le Centre de la NSF pour la biophotonique Sciences et Technologie, l&#39;accord de coopération PHY012099, et un système de santé UCD bourse de recherche à TH UCD CNTC NCRR ULRR024146.

Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al Sciences 323:. 1743-1747 (2009)</a> . 1. Aperçu De cellule à cellule propagation du VIH a été initialement décrite en utilisant des cellules Jurkat infectées au VIH que les cellules du donneur et de cellules CD4 + primaires lymphocytes T comme les cellules d&#39;accepteur 1,2,3. Dans ces études, le virus a été détecté dans les cellules fixes utilisant une coloration d&#39;anticorps. Pour suivre le transfert de virus de cellule à cellule dans les cellules vivantes, nous exploitons un recombinant, clone moléculaire infectieux du VIH appelé VIH Gag-iGFP 4. Il porte la protéine fluorescente verte (GFP) inséré en interne en la protéine Gag entre les domaines MA et CA. Ce clone moléculaire infectieux du VIH conserve sans la nécessité d&#39;un virus assistant. Les particules virales à partir de ce clone sont stoechiométriquement chargé avec la protéine fluorescente verte, fournissant un signal fort de fluorescence pour surveiller l&#39;assemblage viral et de transfert entre cellules. Lorsqu&#39;il est utilisé en conjonction avec la cellule de suivi des inertes colorants fluorescents, les cellules réceptrices peuvent être discriminés à partir des cellules du donneur d&#39;entrée, et permettant de visualiser le transfert du VIH d&#39;une cellule T infectée à une cellule T non infectées 5. La formation des synapses virologiques et le transfert de virus d&#39;une cellule à l&#39;autre peut alors être observé dans les cellules vivantes alors qu&#39;elles sont cultivées dans un récipient hermétique, perméable aux gaz de chambre d&#39;imagerie. (Jour 1) 2. Préparation du VIH Gag-iGFP transfectées cellules Jurkat T <ol><li> Préparer le CD4 + humains T lignée cellulaire Jurkat (ATCC, Manassas, VA) en prenant soin de maintenir les cellules à une concentration comprise entre 2 x 10 5 et 8 x 10 5 cellules / ml dans Jurkat milieux de culture (RPMI 1640, 10% de sérum de veau fœtal, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / mL de streptomycine). La clé du succès: la culture des cellules Jurkat à des concentrations supérieures à 8 x 10 5 cellules / mL se traduira par une réduction de l&#39;efficacité de la transfection. Note: La transfection du VIH Gag-iGFP ADN proviral dans les cellules T, comme décrit ci-dessous, les résultats dans la production d&#39;une compétents pour la réplication du virus de l&#39;immunodéficience humaine. En tant que tel, toutes les procédures doivent être entrepris que par le personnel de laboratoire formé de certification du niveau de biosécurité 2 + ou du niveau de biosécurité 3 (BL2 + / BL3) chambres de culture de tissus. Travailler avec infectieuses VIH dans les établissements d&#39;imagerie doit être approuvé par le bureau de biosécurité institutionnel local. </li><li> Transfecter les Jurkats avec le plasmide virale, le VIH-Gag iGFP en utilisant la méthode nucléofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 cellules par centrifugation pendant 10 min à 150 x g. Aspirer le surnageant et laver les cellules dans une solution saline tamponnée phosphate stérile (PBS). Centrifuger les cellules et resuspendre le culot à 97 ul de pré-chauffé, V solution contenant Nucleofector compléter le fabricant. Ajoutez trois uL d&#39;endotoxine libre VIH Gag-iGFP plasmide (1 ug / uL) à la suspension cellulaire et mélanger doucement. Transférer la suspension cellulaire à une cuvette et nucleofect utilisant le programme S-18. Immédiatement transférer les cellules à 3 mL de milieu de culture préchauffé Jurkat sans antibiotiques. </li><li> Pour préparer les cellules CD4 + cibles pour les synapses virologiques, on obtient des cellules mononucléées du sang périphérique de buffy coats en utilisant un standard Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suède) du protocole. Lymphocytes T CD4 + sont ensuite sélectionnés négativement utilisant un kit d&#39;isolation par billes magnétiques (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Elles peuvent être stockées cryogéniquement dans N2 liquide dans des aliquotes de 5 x 10 6 cells/500 ul de milieux de congélation (90% de veau fœtal serum/10% de DMSO). Décongelé CD4 + primaires des cellules T sont cultivées dans du RPMI 10% SVF, supplémenté avec 10 unités / ml d&#39;IL-2. </li></ol> (Jour 2) 3. Récupération à partir de cellules vivantes avec le VIH Jurkats transfectées Gag-iGFP et la coloration des cellules cibles avec des colorants fluorescents <ol><li> Laisser les cellules Jurkat à se remettre de la transfection nuit. Puis éliminer les débris cellulaires par centrifugation sur un matériau hypaque ficoll gradient de densité. Distribuer 1,5 ml de Ficoll-Paque au fond d&#39;un tube de 15 ml conique. Doucement superposition ce matériel dégradé avec l&#39;Jurkats transfectées dans un volume de 5 mL de RPMI. Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 20 min à température ambiante avec le frein off. Retirez délicatement les cellules de l&#39;interface médias / Ficoll à l&#39;aide d&#39;une pipette. Les transférer à un nouveau 15 ml tube conique. Diluer les cellules avec IPMB à un volume total de 15 ml et centrifuger à 300 xg pendant 10 min. Reprendre le culot dans 3 mL de milieu de culture dans un Jurkat 2 cm et (6-même plaque) et le retour des cellules à l&#39;incubateur de culture tissulaire. </li><li> Afin de distinguer les cellules cibles à partir des cellules du donneur dans les expériences de transfert de cellule à cellule, nous prelabel les cellules CD4 + cibles avec des colorants fluorescents. CD4 + primaires des cellules T sont étiquetés de la mêmeING avant utilisation. Nous avons eu d&#39;excellentes cellules T étiquetage succès avec les deux CellTracker et colorants CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Alors que la concentration de colorant et les temps d&#39;incubation doit être optimisée en fonction du colorant particulier et le type cellulaire utilisé, un protocole représentatives suit. Pellet 4 x 10 6 cellules CD4 + primaires T par rotation à 400 xg pendant 10 min. Laver les cellules avec 5 ml de PBS et de remettre en suspension dans 2 mL de PBS. Ajouter CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) à une concentration finale de 1,5 uM et incuber à 37 ° C pendant 20 min. Ajouter 8 ml de milieu complet et Jurkat centrifuger à 400 xg pendant 10 min. Resuspendre les cellules dans 3 mL de milieu complet supplémenté avec 10 unités / ml d&#39;IL-2 et le placer dans l&#39;incubateur de culture tissulaire pendant la nuit. </li></ol> (Jour 3) 4. Surveillance de cellule à cellule de transfert du VIH Gag-iGFP utilisant imagerie de cellules vivantes Nous utilisons régulièrement le VIH Gag-iGFP cellules Jurkat transfectées 48 heures post-transfection. Cependant, nous avons utilisé avec succès des cellules dès 24 heures, et au plus tard 72 heures après transfection. <ol><li> Environ 48 heures après la transfection, le VIH-Gag iGFP Jurkats exprimer sont comptés, lavés avec du CO 2-médias indépendants (Invitrogen, Carlsbad, CA), et remis en suspension dans l&#39;imagerie cellulaire direct des médias (CO 2 médias indépendants, 10% de sérum fœtal bovin, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / mL de streptomycine, 10 unités / ml d&#39;IL-2) à une concentration de 1-3 x 10 7 cellules / ml. </li><li> De façon similaire, les laver et resuspendre étiquetés CD4 + primaires des cellules T à une concentration de 1-3 x 10 7 cellules / ml en direct des médias d&#39;imagerie cellulaire. </li><li> Mélanger le VIH Gag-iGFP transfectées avec Jurkats CD4 + primaires des cellules T à un ratio de 1:2 ou 1:3 et de la charge dans une culture tissulaire traitée, perméables au gaz, microchambre (ibidi, Vérone, WI). Par exemple, mélanger de 20 uL du VIH Gag-iGFP Jurkats transfectées avec 40 ul de étiquetés CD4 + primaires des cellules T. Charge 50 ul de ce mélange dans une chambre ibidi et sceller la chambre avec des bouchons. Fixez les bouchons en enveloppant le bouchon / interface de chambre ibidi avec du parafilm. </li></ol> 5. Considérations pour les plates-formes de microscopie: disque rotatif imagerie confocale Après le chargement d&#39;une chambre d&#39;imagerie ibidi avec les cellules, nous avons immédiatement monter l&#39;appareil sur un microscope optique inversé (iX71 Olympus, Center Valley, Pennsylvanie). La chambre ibidi devrait être transféré à la loupe seulement par le personnel de laboratoire BL2 + formés portant des vêtements de sécurité appropriés. Bien imagerie des cellules vivantes utilise couramment chambres d&#39;incubation coûteux à maintenir une stabilité à 37 ° C l&#39;environnement, ceci a été réalisé en utilisant un appareil de chauffage simple et économique thermostatique (ASI 400, Nevtek, Williamsville, Virginie) avec une pointe de T-type de thermocouple monté à côté l&#39;échantillon de rétroaction bonne température. Nous avons trouvé à l&#39;aide de CO 2-média indépendant nous permet de maintenir la viabilité des cellules de haute tout en évitant l&#39;utilisation d&#39;une chambre de CO 2. Afin d&#39;atténuer les fluctuations de température plateforme contre dans la chambre et pour bloquer la lumière ambiante de fond, un grand linceul noir est drapée sur l&#39;ensemble microscope / chauffe-setup créer une poche d&#39;air isolant autour du système. Ceci réduit considérablement les variations de température et de la dérive de l&#39;échantillon associée liés à la température, mais nécessite de pré-chauffage pendant 30 minutes avant le montage de l&#39;échantillon. 6. Acquisition de données, de transfert et de traitement d&#39;image Les images sont prises avec un objectif 60x 1,42 NA immersion dans l&#39;huile (UPlanApo N, Olympus) que l&#39;ouverture numérique élevée (NA), améliore considérablement la résolution. Pour créer des images 3D confocale, la numérisation est effectuée par une unité de disque rotatif confocale (CSU-10, Yokagawa, Japon) qui utilise simultanément&gt; 800 places confocale à augmenter considérablement la vitesse de balayage. Pour compléter sa vitesse, la CSU-10 est couplé à une très sensible électrons multipliant dispositif à couplage de charge (EMCCD, ixon + 897, Technologies Andor, Irlande) pour permettre à la caméra rapide, l&#39;imagerie de faible luminosité qui diminue à la fois photoblanchiment et de phototoxicité. La source de lumière de fluorescence est un multi-longueur d&#39;onde ARKR ions de gaz laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), où la longueur d&#39;onde désirée (488 nm) et la puissance du laser mesurée juste avant l&#39;objectif du microscope (&lt;1 mW) sont sélectionnés par un modulateur acousto- optiques filtre accordable (AOTF), (Technologies Andor). Afin de réduire davantage photoblanchiment et d&#39;étendre l&#39;imagerie en temps total, le AOTF rapidement (microsecondes) coupe le faisceau laser à chaque fois que l&#39;appareil est inactif (10-20 ms) tandis que l&#39;image nouvellement acquises est délivrée par le CCD (15-30 ms d&#39;exposition) à l&#39;ordinateur. La lumière laser est couplé au système de disque rotatif utilisant une 405/488/568/647 quadribande miroir dichroïque (Semrock, Rochester, NY). Émission de fluorescence est filtré en utilisant un filtre passe-bande 525 / 50 (Semrock) à l&#39;intérieur une roue à filtres (Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY) monté bntre la caméra EMCCD et l&#39;unité de disque confocale filer. Tout le matériel et l&#39;acquisition, y compris un z-scène (Mad Labs ville, Madison, WI), sont contrôlés par le Andor iQ v1.8 logiciel. Afin de maximiser la vitesse d&#39;acquisition à environ 01/02 à 01/09 secondes piles d&#39;images 3D, nous recadrer la zone d&#39;enregistrement de caméra de l&#39;EMCCD jusqu&#39;au voisinage immédiat de la cellule-paire. Par ailleurs, au détriment de certaines informations en z, un grand z-étape entre 0.45 à 0,75 um peut être utilisé pour accélérer l&#39;acquisition. Imagerie dans ces conditions, peut durer jusqu&#39;à 6 heures - en utilisant en continu de 20 à 60 segments minute - avec photoblanchiment minime. Au total, chaque segment de données occupe généralement 50 à 20 Go d&#39;espace alors que des dizaines de milliers d&#39;images sont prises. Pour faciliter le transport et l&#39;analyse des fichiers de données volumineux, chaque ensemble d&#39;acquisition doit être décomposé et exportés comme une segments TIFF Gb fichier image en utilisant l&#39;Andor iQ v1.8 logiciel. A partir de là, de nombreux logiciels sont disponibles pour une excellente analyse de l&#39;image, comme Metamorph, Volocity et ImageJ (nous vous recommandons de ses îles Fidji variation). Lorsque deux marqueurs fluorescents doivent être suivis, nous enregistrer simultanément deux d&#39;entre eux, sans ralentir l&#39;acquisition en utilisant un &quot;mode écran partagé.&quot; Les deux marqueurs sont excités par deux lignes laser ARKR à la fois (souvent 488 et 568 nm). Inséré directement devant la caméra EMCCD est une image (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK) séparateur qui sépare les deux images différentes. Chaque image est ensuite filtrée de manière indépendante en utilisant des filtres de fluorescence (Semrock) et projetée côte-à-côte sur la caméra à la fois la création du &quot;split-screen&quot; en vigueur. Ce serait alors besoin de culture manuelle et l&#39;alignement des images plus tard dans le traitement d&#39;image. 7. Considérations de traitement d&#39;image et analyse de données Nous généralement effectuer une analyse d&#39;image avec Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) sur les ordinateurs Macintosh (Apple, Inc.) Filature des images de disque laser, microscopie confocale sont d&#39;abord ajustées dans leur intensité pour corriger photoblanchiment, puis déconvoluées avec Volocity. Mesures de l&#39;intensité et le suivi des points lacrymaux Gag est effectué avec le module de quantification Volocity. Pour les ensembles de l&#39;image où le mouvement par rapport à une synapse pré-formé doit être calculé, un algorithme de suivi automatisé est employé qui suit le bouton synaptique à travers la séquence entière. L&#39;inspection manuelle des régions d&#39;intérêt défini par le logiciel Alignement automatique doit être effectuée pour confirmer que le logiciel a correctement suivi l&#39;objet désiré. Pour les objets, où le contraste avec les objets environnants est trop faible, le suivi manuel ne peut être effectuée sur une base trame par trame. Le progiciel permet Volocity l&#39;exportation de l&#39;emplacement XYZ, le volume et le signal intégré dans les objets désirés. La distance entre la synapse et la vitesse de l&#39;objet suivi sont calculées en normalisant les mouvements vers le centre du bouton synaptique. 8. Les résultats représentatifs Dans les 10 à 15 minutes de mélange ne doit être en mesure de visualiser le VIH Gag-iGFP cellules Jurkat exprimant adhérant aux cellules CD4 + primaires T. Imagerie ces conjugués, on peut évaluer les mouvements des points lacrymaux Gag dans les cellules infectées ainsi que dans les cellules cibles après synaspe. On peut observer le mouvement des Gag-iGFP lacrymaux dans les cellules cibles, peu après les synapses se forment.

<ol>
	<li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells.">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li><li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes.">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses.">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li></ol>

Nous décrivons ici une méthode simple pour visualiser le transfert du VIH de la cellule-cellule. Des recherches récentes de notre laboratoire et les autres »suggère que ce pourrait être le mode prédominant de la propagation du VIH entre les cellules T. La méthode décrite ici emploie une forme recombinante du VIH, appelé VIH Gag-iGFP, qui porte une étiquette codée génétiquement la protéine fluorescente verte dans le noyau protéique, Gag structurelles. En raison de niveaux élevés de GFP produite dans chaque particule virale, ce clone compétents pour la réplication du VIH permet aux chercheurs de suivre particules virales en temps réel. Ce virus devrait être particulièrement utile dans les études concernant le transfert d&#39;assemblage et de cellule à cellule du VIH. Le transfert du VIH d&#39;ici à cellules de transfert est très efficace. Pendant une heure trois co-culture, nous la routine voir le virus transféré à 20-30% des cellules T primaires évaluée par cytométrie en flux. Efficacités similaires sont qualitativement vu pendant imagerie des cellules vivantes. Infectées par des virus les cellules T commencent synapses formant avec infectés primaires cellules T presque immédiatement après l&#39;initiation de la co-culture. Intéressant, non pas toutes les écoles primaires des cellules T sont capables d&#39;interagir avec des cellules Jurkat infectées par le VIH, malgré les interactions forcées avec pinces optiques (observations non publiées, GM). VIH Gag-iGFP sera sans doute utile pour déterminer des sous-ensembles de cellules T qui sont plus sensibles à la cellule-cellule de transfert, à la fois in vitro et in vivo.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Jurkat T Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leukocyte buffy coats from whole blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New York Blood Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector System and Solution V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EndoFree Maxi Prep Kits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HIV Gag-iGFP plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chen Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll-Paque</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Celltracker/CellTrace Dyes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-Independent Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ibidi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlanApo N 1.42NA 60X oil objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C ArKr ion gas laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>525/50 bandpass filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ASI 400 Thermostatic Heater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nevtek</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing cell-to-cell transfer of hiv using fluorescent clones of hiv and live confocal microscopy

En fusionnant la protéine fluorescente verte à leurs protéines préférées, les biologistes ont maintenant la possibilité d&#39;étudier les processus cellulaires vivants complexes en utilisant la microscopie à fluorescence vidéo. Pour suivre les mouvements de la protéine virus d&#39;immunodéficience humaine noyau pendant de cellule à cellule de la transmission du virus de l&#39;immunodéficience humaine, nous avons GFP-taggés la protéine Gag dans le contexte d&#39;un clone moléculaire infectieux du VIH, appelé VIH Gag-iGFP. Nous étudions ce clone viral en utilisant la microscopie confocale vidéo. Dans l&#39;expérience suivante visualisées, nous transfecter une lignée cellulaire humaine T avec le VIH Gag-iGFP, et nous utilisons des CD4 non infectés marqués par fluorescence + cellules T pour servir de cellules cibles du virus. En utilisant les différentes étiquettes fluorescentes, nous pouvons facilement suivre la production virale et de transport à travers les structures intracellulaires appelées synapses virologiques. Simple perméables aux gaz chambres d&#39;imagerie nous permettent d&#39;observer des synapses avec la microscopie confocale en direct de minutes à plusieurs jours. Ces approches peuvent être utilisées pour suivre protéines virales comme ils se déplacent dans d&#39;une cellule à l&#39;autre.

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Cette expérience visualisé est un guide pour utiliser un clone moléculaire fluorescent du VIH pour vivre des expériences d&#39;imagerie confocale.

Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.3K vues.  Mount Sinai School of Medicine. Cette expérience visualisé est un guide pour utiliser un clone moléculaire fluorescent du VIH pour vivre des expériences d'imagerie confocale.

Vidéo: Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

Marquage spécifique du VIH-1 des cellules positives à l&#39;aide d&#39;un vecteur Rev-dépendante lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Recherche

Immunologie et infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

Détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d&#39;enveloppe du VIH en utilisant microscopie cryo-électronique et automatisée Sous-tomogramme moyenne

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

Structure du VIH-1 Assemblées capside par cryo-microscopie électronique et reconstruction itérative hélicoïdal espace réel

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Prédiction du VIH-1 Utilisation corécepteur (tropisme) par analyse de séquence en utilisant une approche génotypique

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

En décapsidation in vitro du VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d&#39;enveloppe l&#39;aide d&#39;un base de cellules test ELISA

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolement des exosomes dans le plasma du VIH-1 individus positifs

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.