Cette méthodologie est importante en ce sens qu’elle permet une méthode reproductible et précise pour quantifier les produits pharmaceutiques appliqués par voie topique à l’aide d’une imagerie Raman cohérente. D’autres méthodologies fournissent des informations pharmacocinétiques cutanées volumineuses, tandis que cette méthodologie peut fournir des informations pharmacocinétiques cutanées en vrac et à l’échelle microscopique telles que la voie de perméation d’un médicament. Les voies de visualisation, de quantification et de perméation permettront le développement de produits pharmaceutiques ayant une voie spécifique en tête pour atteindre le site cible.
La préparation des tissus s’avérera être la partie la plus difficile de cette méthodologie. Le tissu doit être suffisamment mince pour que l’on puisse lire à travers la peau. Pour commencer la préparation d’un tissu cutané d’oreille de souris nue, acquérir des souris nues euthanasiées et enlever les oreilles de la souris à l’aide de pinces et de ciseaux microchirurgicaux.
Ensuite, placez une oreille dans une grande boîte de Petri de taille 60 millimètres par 15 millimètres. Ensuite, rincez l’oreille de la souris avec PBS deux fois et tapotez l’oreille sèche à chaque fois avec l’essuie-glace de tâche. Si utilisé dans les 24 heures, placez l’oreille dans PBS dans une petite boîte de Petri de 35 millimètres sur 10 millimètres à deux à huit degrés Celsius.
À utiliser après 24 heures de récolte, placez l’oreille dans une boîte de Petri sans PBS, puis couvrez la boîte avec un parafilm pour la conserver au congélateur à moins 20 degrés Celsius. Tout en travaillant sous le capot biologique, placez le tissu cutané humain dans une grande boîte de Pétri avec le côté de la couche cornée vers le bas afin que la graisse sous-cutanée soit accessible. Ensuite, utilisez des pinces et des ciseaux microchirurgicaux pour éliminer la graisse sous-cutanée.
Une fois que la graisse sous-cutanée ne peut plus être enlevée avec les ciseaux, utilisez un scalpel jetable à 10 lames à un angle de 45 degrés par rapport à la peau pour éliminer la graisse sous-cutanée restante tout en maintenant la peau immobile avec une pince. Lorsque la graisse est enlevée, divisez la peau humaine en morceaux d’un centimètre par un centimètre. Pour l’imagerie lipidique, placez la partie antérieure de l’oreille de la souris vers le fond en verre d’un plat de 35 millimètres, numéro zéro.
Pour la peau humaine, placez la peau avec la couche cornée face cachée pour permettre la quantification du médicament des couches superficielles aux couches plus profondes. Une fois que le tissu a été centré sur le fond en verre, utilisez un applicateur à pointe de coton pour vous assurer que la peau est plate et a un contact complet avec la surface de glissement de couverture du plat inférieur en verre. Pour éviter tout mouvement lors de l’imagerie, placez une rondelle sur le dessus de la peau et assurez-vous que le tissu est visible à travers le trou central de la rondelle pour la détection de la diffusion Raman stimulée ou de la transmission SRS.
Pipette la dose prédéterminée de la formulation sur la peau, puis utiliser un doigt ganté pour frotter la formulation dans le sens des aiguilles d’une montre pendant 30 secondes. Une fois que le temps alloué pour que la formulation pénètre s’est écoulé, retirez l’excès de formulation avant de placer la peau avec le côté de la formulation tourné vers le plat inférieur en verre. Ensuite, passez à la configuration expérimentale en activant le logiciel Microscope Control ou MC.
En regardant à travers l’oculaire, ajustez la mise au point axiale avec le bouton de réglage pour vous assurer que le tissu est au point. Lorsque vous avez terminé, débloquez les faisceaux de pompe et de Stokes et confirmez que les canaux ALG1 et ALG2 sont activés. Assurez-vous que la photodiode SRS est en position au-dessus du condenseur, puis cliquez sur Focus x2 sur le logiciel MC pour visualiser la peau dans les canaux CARS et SRS.
Dans le module Multi-Area Time Lapse ou MATL, accédez à l’onglet Affichage et cliquez sur la liste des points enregistrés pour que la liste d’imagerie apparaisse. Une fois la couche cornée identifiée, faites défiler le foyer axial ou le foyer Z pour identifier des stratifications tissulaires spécifiques. Des profondeurs spécifiques peuvent être ajoutées dans la peau telles que la couche cornée, les glandes sébacées, les adipocytes ou la graisse sous-cutanée, telles que déterminées lors de l’imagerie en direct avec un contraste accordé aux lipides.
Toutefois, si des piles de profondeur entières doivent être prises, des positions XY peuvent être ajoutées et la position Z relative peut être ignorée. Dans le cas d’une profondeur spécifique d’imagerie pour chaque stratification de peau, sélectionnez le point de registre pour l’ajouter à la file d’attente MATL. Pour les piles de profondeur complète, cliquez sur Enregistrer le point pour chaque position XY avec sélection de profondeur dans la fenêtre Paramètres d’acquisition.
Ensuite, définissez le nombre de répétitions sur un dans le module MATL et cliquez sur Prêt. Lorsque la flèche Lecture passe du gris au noir, appuyez sur Lecture pour commencer à imager la pile lipidique préliminaire. Une fois le cycle d’imagerie terminé, bloquez les faisceaux de pompe et de Stokes et modifiez la longueur d’onde sur l’interface utilisateur graphique du laser à la longueur d’onde souhaitée en fonction du nombre d’ondes ciblées ou de la vibration Raman.
Ajustez l’étape de retard manuel tout en vous assurant que les mêmes pouvoirs sont utilisés pour imager le lipide et l’ingrédient pharmaceutique actif ou l’API qui sont établis a priori. Une fois que le nombre total de répétitions de cycle a été choisi, débloquez le faisceau de la pompe et vérifiez si la puissance correspond à la puissance souhaitée à l’aide de la photodiode avant d’appuyer sur Lecture pour commencer l’imagerie automatisée des points de consigne. Ensuite, effectuez une analyse des données pour chaque stratification de la peau en important une image lipidique de la glande sébacée dans Fidji et en cochant la case intitulée Canaux divisés pour diviser le fichier en canaux CARS et SRS.
Pour ouvrir la région d’intérêt ou le gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Analyser, Outils et Gestionnaire de retour sur investissement. À l’aide du canal SRS tel que C soit égal à un, dégroupez la glande sébacée de l’image et ajoutez les marques au gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Ajouter T dans le gestionnaire de retour sur investissement. Répétez le processus pour chaque glande sébacée de l’image.
Pour masquer les régions riches en lipides, sélectionnez chaque retour sur investissement, puis cliquez sur Plus, OU Combiner et Ajouter des onglets. Pour masquer les régions pauvres en lipides, utilisez l’outil Rectangle du menu Fidji et dessinez un carré autour de l’image entière. Ajoutez la région au Gestionnaire de retour sur investissement.
Cliquez sur le ROI carré nouvellement ajouté en plus du ROI qui sélectionne toutes les régions riches en lipides dans le Gestionnaire de ROI. Sous Plus, sélectionnez XOR pour générer un masque des régions pauvres en lipides et l’ajouter au gestionnaire de retour sur investissement. Concaténez les images dans l’ordre numérique en accédant à Image, Piles, Outils et concaténez les onglets dans l’ordre.
Vous pouvez également importer les images en en chargeant une dans Fidji, puis en sélectionnant une option appelée Fichiers de groupe avec des noms similaires sur la page de configuration. Tout en ayant l’image concaténée active, accédez au Gestionnaire de retour sur investissement pour sélectionner les régions riches en lipides et cliquez sur l’onglet Plus avant de sélectionner Multi Measure, puis attendez que la fenêtre Résultats apparaisse. Dans la fenêtre Résultats, exportez les données vers une feuille de calcul et ajoutez une colonne intitulée Région pour ajouter des régions riches en lipides à chaque ligne de données.
Ajoutez des lipides pauvres aux régions qui étaient en dehors des lipides. Pour visualiser les données, enregistrez et importez la feuille de calcul dans le package R, ggplot2. Ensuite, tracez les données en fonction du nombre d’images par rapport à l’intensité moyenne pour estimer les données de temps de concentration.
Exécutez une analyse non compartimentée ou NCA dans RStudio sur les données de temps d’intensité importées de la feuille de calcul avec l’appel d’une couche. Lorsque vous avez terminé, tracez et comparez visuellement les métriques Jmax et AUCflux-all. De plus, effectuez des comparaisons statistiques entre les conditions expérimentales.
L’analyse représentative décrit la couche cornée, les glandes sébacées, les adipocytes, la graisse sous-cutanée de la peau de l’oreille de souris nue et la couche cornée, le derme papillaire et une glande sébacée de la peau humaine. Dans la peau de l’oreille de souris nue, le mouvement tissulaire limité des glandes sébacées a été observé avec la même profondeur tissulaire des glandes au moment de l’application de la formulation et 120 minutes après l’application. Le mouvement tissulaire important dans la peau a montré des glandes sébacées à peine visibles après 120 minutes d’application du médicament, démontrant l’inefficacité du protocole original.
Dans plusieurs études, les profils d’intensité par rapport au temps ont montré des concentrations initiales élevées, suivies de concentrations décroissantes, indiquant qu’il n’y avait plus d’absorption du médicament dans les tissus. D’autre part, certaines études ont indiqué une augmentation des intensités qui a ensuite diminué au cours de la durée expérimentale, démontrant que le flux dans le tissu n’avait pas atteint un maximum avant l’imagerie. L’analyse NCA des profils concentration-temps de deux formulations pour la même API a indiqué que l’éthoxy-éthoxyéthanol offrait une perméation API étendue par rapport à celle de la formulation en gel quelle que soit la couche de peau.
L’analyse de l’exposition totale entre les mêmes formulations a montré des observations similaires dans les couches profondes de la peau. La préparation de la peau humaine et le placement approprié de la peau sur le plat de fond en verre après l’application du médicament sont essentiels au succès de l’expérience. Les solutions claires ici ont démontré la pertinence de cette méthodologie.
D’autres recherches porteront sur des formulations commercialisées telles que des crèmes pour comprendre l’impact de la formulation sur la pénétration et la perméation des API.
