Ce protocole compare les deux techniques de diffusion Raman cohérente hyperspectrale les plus largement utilisées, y compris la diffusion Raman anti-Stokes cohérente et les processus de diffusion Raman stimulés, ce qui permet aux biologistes de choisir la meilleure modalité d’imagerie pour leurs applications biologiques. En utilisant les signatures vibratoires intrinsèques, la spectroscopie Raman cohérente est capable de cartographier des informations chimiques et des échantillons biologiques sans avoir besoin d’un marquage exogène. La microscopie Raman cohérente a élargi notre compréhension du métabolisme cellulaire, de la cartographie, de la distribution des médicaments, du diagnostic des maladies et de la quantification des changements chimiques.
Il s’agit d’une technique qui nécessite une formation suffisante en optique et en spectroscopie. Je recommanderais de lire quelques articles de synthèse et d’être formé par un expert avant d’utiliser cette technique. Pour commencer, préparez les diapositives d’imagerie en plaçant un morceau de ruban adhésif double face sur un couvercle et en découpant une petite forme rectangulaire du ruban adhésif au milieu du ruban adhésif pour créer une zone ouverte pour l’échantillon à placer.
Pipette 1 à 2 microlitres de DMSO pur et distribuer la gouttelette au centre de la vacance. Placez délicatement le glissement du couvercle supérieur et placez doucement les bords des glissières du couvercle pour sceller la chambre tout en vous assurant que l’échantillon de DMSO n’entre pas en contact avec les bords du ruban adhésif. Pour les expériences de sensibilité, préparer des dilutions en série de DMSO dans de l’oxyde de deutérium pour donner une plage de concentration de 50 à 0%Prendre 1 à 2 microlitres de chaque solution et préparer des échantillons pressés comme démontré précédemment.
Placez l’échantillon sur l’étage du microscope et ajoutez de l’eau ou de l’huile d’immersion si nécessaire pour la lentille de l’objectif ou le condenseur. Déplacez correctement le bord de la gouttelette DMSO dans le champ de vision et ajustez l’objectif pour obtenir la meilleure mise au point, puis centrez le condenseur à l’aide de la méthode d’éclairage Kohler et ouvrez complètement le diaphragme sur le condensateur. Ensuite, réglez la longueur d’onde du faisceau de la pompe à 800 nanomètres pour cibler le pic CH3 du nombre d’onde 2913 et réglez la puissance de la pompe et du faisceau stokes à environ 30 milliwatts avant le microscope en ajustant la demi-plaque d’onde.
Pour SRS, réglez le gain de l’amplificateur de verrouillage à environ 10 avec une constante de temps de 7 microsecondes, en vous assurant que la constante de temps est inférieure au temps de séjour en pixels. Définissez les paramètres d’acquisition d’image et le logiciel d’acquisition à l’aide d’un nombre de pixels de 200 par 200 avec une taille de numérisation d’environ 100 x 100 micromètres carrés, en vous assurant que l’image contient à la fois la gouttelette de DMSO et une zone vide, puis numérisez l’échantillon et vérifiez l’image sur l’écran de l’ordinateur. Ensuite, scannez l’image de retard motorisée dans le faisceau de la pompe Stokes tout en surveillant les images en temps réel et scannez le délai jusqu’à ce que le signal soit maximisé.
Déplacez la gouttelette DMSO pour couvrir tout le champ de vision et vérifiez si le signal CC maximal est centré dans l’image car le signal dépend du faisceau de la pompe. Ajustez soit la position du faisceau de la pompe via un miroir, soit le décalage de tension dans le logiciel d’imagerie. Après l’optimisation DC, ajustez les miroirs de faisceau Stokes jusqu’à ce que le signal AC soit maximisé en ajustant la valeur de seuil pour afficher une saturation d’environ 50% tout en vérifiant que la saturation est centrée dans l’image.
Sinon, affinez les miroirs uniquement dans le faisceau Stokes et surveillez le signal pendant l’alignement en tant que rétroaction en temps réel sur la qualité de l’alignement. Pour l’analyse SNR, ouvrez le logiciel ImageJ et importez l’exemple de fichier texte DMSO enregistré en cliquant sur Fichier, puis sur Importer, suivi des options Image texte et Ouvrir du menu déroulant. Une fois l’image importée, appuyez sur Control Shift C pour afficher la fonction Luminosité et contraste, puis appuyez sur le bouton Auto de la fonction Luminosité et contraste jusqu’à ce que la région de l’échantillon DMSO apparaisse saturée pour trouver le signal d’échantillon maximal.
Ensuite, cliquez sur l’outil de sélection Ovale sur l’interface ImageJ et mettez en surbrillance une petite zone de la région DMSO saturée. Après la mise en surbrillance, appuyez sur M pour mesurer la moyenne et l’écart-type de la zone sélectionnée. Pour mesurer l’arrière-plan, ajustez les barres dans la fonction Luminosité et contraste jusqu’à ce que le signal de la région vide puisse être observé, puis cliquez sur la sélection Ovale et mettez en surbrillance une région de l’arrière-plan, en vous assurant que la région sélectionnée ne contient pas de DMSO.
Ensuite, appuyez sur M pour mesurer les statistiques de la zone sélectionnée. Ensuite, calculez le SNR comme démontré précédemment en mesurant la valeur moyenne du bruit et la valeur moyenne du signal ainsi que l’écart type. Pour traiter les images CRS hyperspectrales, importez le fichier texte en cliquant sur les options Fichier, puis Importer, Image texte et Ouvrir dans le menu déroulant.
Une fois importé, cliquez sur Image, puis sur Piles, puis sur Outils et Options Montage à pile pour convertir le fichier en pile d’images, puis faites défiler le montage jusqu’à ce que le premier pic DMSO soit visible. Sélectionnez une région sur le DMSO et cliquez sur Image, puis sur les options Empiler et Tracer le profil de l’axe Z pour tracer l’intensité par rapport au spectre du nombre d’images. Ensuite, cliquez sur Liste et copiez les données de profil pour extraire les données spectrales brutes.
Pour convertir le spectre récupéré en unités de fréquence, effectuez une régression linéaire en utilisant l’étirement CH symétrique et asymétrique du DMSO et leurs nombres de trames correspondants. La résolution spectrale du DMSO a été mesurée à l’aide d’une microscopie hyperspectrale SRS et CARS, qui montrent une résolution de 14,6 et 17,1 nombres d’onde respectivement, indiquant que SRS a une meilleure résolution spectrale. Les spectres SRS DMSO ont été obtenus à des concentrations de 0,1 et 0,01% dans lesquelles le pic au nombre d’onde 2913 peut être résolu dans le premier, mais pas dans le second, indiquant que la limite de détection est comprise entre 0,1 et 0,01% DMSO.
Les spectres CARS récupérés en phase montrent que le pic du nombre d’onde DMSO 2913 peut être clairement résolu pour le 0,1% DMSO, mais pas pour le 0,01% indiquant une limite de détection entre ces deux concentrations. Les profils d’intensité SRS et CARS d’une cellule MIA PaCA-2 ont démontré que le signal SRS donnait une résolution de 398,6 nanomètres, tandis que le signal CARS donnait une résolution 1,2 fois meilleure de 330,3 nanomètres. Les images SRS et CARS des cellules MIA PaCa-2 à différentes positions de retard optique montrent les signaux les plus forts avec des gouttelettes lipidiques comme points lumineux pour SRS, tandis que CARS ont des contrastes beaucoup plus réduits.
Cependant, un décalage de 37 numéros d’onde vers le rouge dans la focalisation spectrale a amélioré les contrastes lipidiques pour SRS et CARS. Les spectres SRS montrent un signal beaucoup plus fort à 2850 nombre d’onde pour les gouttelettes lipidiques que les autres organites, tandis que les spectres CARS montrent un petit décalage vers le rouge. Pour optimiser le signal de diffusion Raman cohérent, trouvez d’abord la mise au point de l’échantillon, puis réglez le retard optique et enfin, ajustez les miroirs jusqu’à ce qu’un maximum soit atteint.
D’autres technologies de pompe-sonde, telles que l’absorption transitoire, sont intrinsèquement intégrées à la plate-forme CRS. Cette technologie est très puissante pour mesurer la cinétique d’absorption de fortes molécules non fluorescentes absorbant la lumière. Cette technique permet aux chercheurs de visualiser de petites molécules sans étiquette avec une activité cellulaire chimique élevée.
Il permet également aux chercheurs de voir les changements dans le métabolisme des lipides, la dynamique intracellulaire et la distribution des médicaments.
