La méthode que nous allons démontrer aujourd’hui fournit une solution à haut débit pour évaluer la séroconversion des anticorps associés aux infections COVID-19 ou à la vaccination pour des analyses de routine. Fait intéressant, cette approche nous permet d’évaluer plusieurs épitopes sur le même analyte. Cela a de nombreuses applications dans les sciences biologiques, y compris les études de signalisation cellulaire et la surveillance des réponses immunitaires.
Vous démontrerez cette technique aujourd’hui par le Dr Imad Tarhoni, boursier postdoctoral dans mon laboratoire. Pour commencer, sélectionnez trois flacons différents des microsphères magnétiques avec des régions de perles uniques et enregistrez l’ID de perle et les informations de lot pour chaque flacon utilisé. Ensuite, vortexez le stock de microsphère sélectionné pendant 60 secondes et soniquez pendant cinq minutes.
Transférer 1,0 fois 10 aux six billes dans un tube de microcentrifuge à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre et insérer le tube dans un séparateur magnétique. pour permettre la séparation pendant 60 secondes. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille de perle.
Retirez le tube du séparateur magnétique, puis remettez en suspension les billes avec 100 microlitres d’eau de qualité HPLC et de vortex pendant 30 secondes. Encore une fois, replacez le tube dans le séparateur magnétique pendant 60 secondes et retirez ensuite le surnageant. Répétez le protocole de lavage deux fois.
Après le dernier lavage, retirez le tube du séparateur magnétique et remettez en suspension les microsphères lavées dans 90 microlitres de tampon d’activation, pH 6,2, par vortex pendant 30 secondes. Ensuite, traiter séquentiellement les microsphères avec 10 microlitres de 50 milligrammes par millilitre d’anhydroxy-sulfosuccinamide et 10 microlitres de 50 milligrammes par millilitre de solution d’EDC par vortex pendant 10 secondes. Plus tard, incuber les microsphères pendant 20 minutes à température ambiante avec un léger vortex toutes les 10 minutes.
Après l’incubation, lavez les microsphères deux fois avec du MES de 50 millimolaires ou un tampon de couplage, pH 5,0, comme décrit précédemment. Répétez le lavage deux fois. Une fois cela fait, retirez le tube du séparateur magnétique et remettez en suspension les billes avec 100 microlitres de tampon de couplage par vortex pendant 30 secondes, puis ajoutez immédiatement la quantité de protéine souhaitée au tube.
Porter le volume total à 150 microlitres avec tampon de couplage et mélanger la réaction par vortex pendant 30 secondes. Ensuite, incubez le tube pendant deux heures par rotation à température ambiante. Après incubation, lavez les microsphères deux fois avec un tampon de trempe PBS et remettez en suspension les microsphères lavées dans 100 microlitres de tampon de trempe contenant 0,05% d’azoture de sodium par vortex pendant 30 secondes.
Comptez le nombre de microsphères récupérées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et enregistrez la concentration de billes observée. Pour les performances de dosage, remettez en suspension les microsphères couplées par vortex pendant 30 secondes et soniquez pendant 60 à 90 secondes. Ensuite, retirez la quantité requise de chaque colloïde de perle du tube respectif et combinez les colloïdes de perles dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.
Ensuite, insérez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation pendant 60 secondes. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez le surnageant sans perturber la pastille de perle. Après avoir retiré les billes du séparateur, remettez les perles en suspension dans 100 microlitres de tampon d’essai.
Vortex pendant 30 secondes avant de placer le tube dans un séparateur magnétique pendant 60 secondes pour séparer les perles. Répétez le lavage deux fois. Ensuite, ajustez la concentration du mélange de microsphères de travail à trois plex en ajoutant un volume approprié de tampon d’essai pour générer une concentration finale de 100 microsphères par microlitre pour chaque cible.
Aliquote 25 microlitres du mélange de microsphère dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Diluer les échantillons de plasma ou de sérum 500 fois dans le tampon d’essai et préparer les échantillons standard selon le titrage souhaité. Ajouter 25 microlitres de tampon d’essai comme échantillon vierge et ajouter chacun des spécimens dilués ou étalons dans chaque puits désigné d’une plaque d’échantillon de 96 puits.
Lorsque vous avez terminé, couvrez la plaque avec un joint ou une feuille d’aluminium pour incuber pendant une heure à température ambiante sur un agitateur à plaque réglé sur 700 rotations par minute. Préparer une solution d’anticorps anti-détection humaine ou de solutions d’anticorps secondaires à quatre microgrammes par microlitre avec un tampon d’essai tel que décrit dans le manuscrit. Placez la plaque sur un séparateur magnétique pour laver rapidement, puis inversez de force la plaque au-dessus d’un récipient à risque biologique pour éliminer le liquide des puits.
Avec la plaque toujours inversée, tapotez-la avec force contre une épaisse liasse de papier. Ensuite, lavez chaque puits avec 100 microlitres de tampon d’essai et retirez le liquide par inversion forcée sur un récipient à risque biologique. Répétez le lavage deux fois.
Après le dernier lavage, jetez toutes les liasses de papier usagées dans un récipient contenant contenant un risque biologique. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution de travail d’anticorps secondaires à chaque puits d’une plaque de 96 puits et recouvrez la plaque de papier d’aluminium pour incuber sur un agitateur à plaque à 700 rotations par minute. Après 30 minutes d’incubation, laver les puits de la plaque deux fois avec un tampon d’essai comme démontré précédemment.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon d’essai dans chaque puits de la plaque de 96 puits. Couvrir la plaque avec du papier d’aluminium et incuber pendant cinq minutes sur un agitateur à plaque à température ambiante. Analysez un échantillon de 60 microlitres via l’analyseur d’instruments conformément au manuel du système.
Pour optimiser le temps d’incubation de la capture de l’échantillon, incuber les plaques pendant une durée de 30, 60 et 120 minutes. Après l’incubation, analysez 60 microlitres du mélange d’essai sur l’analyseur. Une courbe standard en sept points basée sur une série de dilution en série 1:5 a été évaluée pour le pic S1, les anticorps membranaires et la nucléocapside.
Le test de précision intra-essai a été effectué sur la plaque pour évaluer la précision du test calculée en pourcentage de coefficient de variation, d’écart type et de moyenne. Pour la précision entre les essais, trois lots distincts des ensembles de perles ont été préparés pour chaque essai. Les variables de précision du test avec l’étalon et les échantillons de plasma humain ont été calculées.
Les valeurs moyennes d’intensité fluorescente médiane à 120 minutes de l’incubation étaient optimales pour les titres d’IgG pour le pic S1, la membrane et les anticorps nucléocapsides, indiquant une cinétique de liaison rapide des anticorps primaires. Les optimisations de la concentration d’anticorps secondaires dans la performance à double canal ont démontré une large gamme de signaux dans la mesure linéaire pour toutes les concentrations. Les signaux observés lors de différentes incubations temporelles des anticorps secondaires et les détails sur les changements de signal pour tous les temps d’incubation sont montrés ici.
Dans les évaluations de spécificité pour les essais à double canal, une contamination négligeable du signal croisé a été observée entre le canal blanc et le canal rapporteur unique. Dans l’illustration des événements de séroconversion après la vaccination contre la COVID-19, les valeurs de pointe observées des IgA et des IgM de pointe étaient environ 40 fois inférieures aux titres d’isotype d’IgG. Cette méthode a des implications importantes pour la surveillance de la réponse aux vaccins chez les personnes immunodéprimées.
Cela nous permettra de déterminer si ces patients sont vraiment protégés par ces vaccinations.
