Ce protocole nous permet de surveiller la dynamique d’interaction et la résolution de la jonction Holliday par rabat endonuclease 1 au niveau d’une molécule unique et d’autres systèmes enzymatiques. Eh bien, certains seront en moyenne dans toute la population moléculaire ou sécurise les étapes mécanistes individuelles sous-jacentes et il ya. Les méthodes à molécule unique fournissent ces détails en surveillant le comportement en temps réel des molécules individuelles.
Les méthodes à molécule unique peuvent détecter efficacement les interactions biomoléculaires dans la gamme pico et nanomolaire avec une grande spécificité. Ce qui est pratique pour de nombreuses solutions pratiques dans le diagnostic, le séquençage du génome et la détection. Les méthodes optiques et forcées de mesure à molécule unique sont largement appliquées en physique, chimie et biologie et sont prouvées pour fournir des observations nobles qui sont inaccessibles par d’autres méthodes.
Mon conseil aux utilisateurs pour la première fois est de suivre de près les étapes détaillées énoncées dans ce protocole. Les illustrations visuelles de la procédure pratique de ce protocole mèneront à la mise en œuvre réussie de la technique. Pour préparer la cellule d’écoulement d’un seul canal, commencez par percer deux trous de 1,22 millimètre de diamètre dans la partie centrale d’une glissière de quartz de 50 x 20 millimètres avec les centres à 37 millimètres l’un de l’autre et à 6,5 millimètres du bord de la glissière.
Utilisez un coupeur électronique pour couper un canal de 41 par 2,25 millimètres dans un morceau de 50 x 20 millimètres d’une double feuille d’adhésif et décoller le côté plastique du couvercle protecteur. Alignez les bords de la pièce avec les bords de la glissière de quartz et utilisez une paire de pinces à épiler en polytétrafluoroéthylène pour enlever délicatement les bulles d’air emprisonnées. Peler le côté papier de la pièce adhésive et monter la pièce sur la surface fonctionnalisée d’un glissement de couvercle.
Ensuite, coupez un morceau de tube de polyéthylène d’un diamètre interne de 1,22 millimètre à une longueur de 11 centimètres pour l’entrée et un morceau de tube à 25 centimètres pour la sortie. Insérez ensuite les tubes dans les trous précédemment percés comme tubes d’entrée et de sortie pour la cellule d’écoulement. Et utilisez de la colle époxy de cinq minutes pour sceller les bords de l’interface de glissement de couvercle de quartz dans les tubes d’entrée et de sortie.
Lorsque la cellule a séché, utilisez une seringue de 1 millimètre pour rincer 0,2 micromètre filtré 0,03 milligramme par avidine de concentration millilitre dans PBS dans la cellule à l’aide d’une deuxième seringue remplie de tampon seul pour laver tout excès d’avidine à la fin de la profusion. Pour effectuer une expérience FRET monocolore, appliquez d’abord une goutte d’huile d’immersion sur un objectif de fluorescence de réflexion interne 100 fois le total et réglez la multiplication sur puce des photoélectrons à un gain approprié pour optimiser le signal à l’arrière-plan et pour éviter la saturation. Placez soigneusement la cellule d’écoulement sur le support de l’échantillon et utilisez le réglage du cours pour augmenter graduellement l’objectif jusqu’à ce que l’huile touche le glissement de couvercle.
Allumez le laser de 532 nanomètres et passez au mode d’ajustement fin de l’objectif. Dirigez l’émission vers le port de la caméra pour observer l’image sur le moniteur et ajuster la hauteur de l’objectif jusqu’à ce que la surface fonctionnalisée du glissement de couverture soit mise au point et puisse être observée sur le moniteur. Vérifiez que l’arrière-plan de la surface fonctionnalisée des glissements de couverture ne dépasse pas quelques taches avant de couler dans le HJ étiqueté fluorescent. Lorsque le système est prêt à 0,2 à 0,5 microlitres du substrat dilué d’intérêt dans 120 microlitres de tampon d’imagerie avec système de décature de l’oxygène dans un tube de 0,5 millilitre et connecter la sortie de la cellule lente à une pompe à seringues.
Insérez le tube d’entrée dans le tube de 1,5 millilitre et démarrez la pompe à seringues à une minute de 30 à 50 microlitres pour retirer la solution du tube. Imagez fréquemment brièvement la surface avec le laser vert pour confirmer une bonne couverture de la cellule avec 100 à 300 particules de substrat homogènement distribué et bien espacé. Si la surface de la cellule d’écoulement est adéquatement couverte, rincer 120 autres microlitres de tampon d’imagerie à 30 à 50 microlitres par minute pour laver tout HJ non lié et permettre à la cellule d’écoulement de s’asseoir pendant 5 minutes pour permettre au système de scavaging d’oxygène d’épuiser l’oxygène dissous.
Réglez le temps d’exposition à environ 60 millisecondes. Le temps de cycle sera automatiquement défini par le logiciel en fonction de la vitesse de transfert de données. Spécifiez le nombre désiré de cycles ou d’images à environ 400.
L’émission du donneur et des fluorophores accepteurs sont divisées en canaux de couleur par un dispositif de splitter d’image. Sélectionnez une zone appropriée sur la surface, ajustez la hauteur de l’objectif pour concentrer l’image et enregistrer et enregistrer le film en format tiff 16 bits. Ensuite, déplacez-vous vers une nouvelle zone.
Rincer la cellule avec 120 microlitres de tampon d’imagerie complétés par les concentrations indiquées de GEN1 à un débit de 30 microlitres par minute, une concentration à la fois. Dans la résolution de l’expérience de clivage HJ, ajuster le débit à 110 microlitres par minute et commencer l’enregistrement 5 à 10 secondes avant l’entrée de l’enzyme dans la cellule d’écoulement. l’imagerie pour commencer 5 à 10 secondes avant l’entrée de l’enzyme dans la cellule d’écoulement maximisera le nombre d’événements.
Lorsque toutes les concentrations ont été testées, utilisez une perle fluorescente fixe pour cartographier les particules du donneur et de l’accepteur les unes aux autres dans le dispositif de fractionnement de l’image. Après avoir installé le logiciel approprié pour générer une matrice de transformation, ouvrez le film de diapositives de perles enregistré et sélectionnez les positions des perles individuelles dans les canaux donneur et accepteur. Lorsque la matrice a été générée à partir de la diapositive de perle fixe cliquez sur Charger TFORM et sélectionnez le fichier de matrice de transformation.
Dans le menu de drop down du filtre de canal, cliquez sur l’option D&A pour sélectionner les particules étiquetées avec le donneur et l’accepteur. Ensuite, entrez plotTimetraceCW comme indiqué dans le manuel pour générer les traces de temps pour chaque molécule. Pour réaliser une expérience ALEX FRET, enregistrez un film composé d’images consécutives d’émissions de donneurs et d’accepteurs par des excitations directes avec les lasers verts et rouges.
Ouvrez les films ALEX acquis et fixez le seuil de détection approprié à environ 300 pour chacune des émissions des donneurs en raison de l’excitation du donneur, de l’émission de l’accepteur due à l’excitation des donneurs et de l’émission d’accepteur en raison des canaux d’excitation directe. Appliquez les filtres de canal appropriés pour sélectionner les particules qui ont été à la fois donneur et accepteur et reliez 200 à 300 particules dans chacun des trois canaux. Utilisez le code MATLAB plotHistALEX pour générer des histogrammes ALEX correspondant à différents pics dans les fonctions de l’histogramme et utilisez un programme de graphique et d’analyse approprié pour déterminer le pourcentage de la zone sous la courbe pour chaque population.
Utilisez ensuite le code MATLAB plotTimetraceALEX pour générer une trace de temps pour chaque molécule montrant l’émission du donneur par l’excitation directe dans les émissions de l’accepteur due au FRET et à l’excitation directe. Cet histogramme fret d’excitation alternant représentatif de l’étiquette adjacente X-0 montre deux pics qui correspondent à l’échange des isomères plus abondants et moins abondants. Les taux d’isomérisation obtenus à partir des histogrammes de temps de habit des isomères sont compatibles avec ceux rapportés précédemment.
Les histogrammes fret à molécule unique de la jonction adjacente de l’étiquette X-0 à différentes concentrations GEN1 acquises par ALEX, révèlent un pic correspondant à l’isomer fret élevé libre et un pic correspondant à la population liée de HJ après avoir soustrait la contribution de l’isomer moins abondant du pic fret faible. À une concentration GEN1 saturante, l’histogramme fret de X-0 n’a qu’un seul pic fret faible correspondant à GEN1 lié à l’un ou l’autre isomer du HJ comme prévu par le modèle. La liaison du monomère GEN1 au HJ suivie de la formation de dimère est une caractéristique unique de la resolvase eucaryotique HJ GEN1 par rapport aux resolvases procaryotes qui existent sous forme dimérique en solution.
D’autres preuves que gen1 monomère lie et déforme le HJ est l’observation d’un nombre important de traces de particules uncleaved avec un état stable faible FRET en présence de magnésium à de faibles concentrations GEN1. Le départ simultané du donneur et de l’accepteur après un état stable de fret faible dans les traces de X-0 résolu qui se produit sans l’émergence d’un intermédiaire indique qu’une résolution complète se produit dans la durée de vie du complexe GEN1 HJ. Notez que l’arrière-plan de la surface de verre fonctionnalisée ne doit pas dépasser quelques taches et que des particules réparties uniformément sont essentielles pour obtenir de bons résultats.
Utilisez toujours de l’équipement de protection individuelle et une hotte de fumée tout en préparant l’image de sérialisation. Assurez-vous de porter des lunettes de protection spécifiques aux longueurs d’onde lorsque vous travaillez avec des lasers. D’autres méthodes telles que cryo ap, résonance magnétique nucléaire, peuvent fournir des détails structurels au niveau atomique.
Ces informations font partie intégrante de la conception et de l’interprétation des expériences FRET à molécule unique. Fret molécule unique ouvrir de nouvelles vues dans le domaine de la réplication de l’ADN résultant en une meilleure compréhension des mécanismes des actions helicases et nucléases.
