Ce protocole permet l’émission de champs électriques pulsés par électronique flexible pour étudier leurs effets thérapeutiques sur le glioblastome. Pour ce faire, nous visualisons le microenvironnement tumoral in vivo avec l’imagerie. La bioélectronique s’intègre dans ce protocole en utilisant plusieurs modèles différents de complexité croissante afin d’étudier l’effet des champs pulsés sur le cancer.
Les techniques de microfabrication présentées dans ce travail peuvent également être testées comme moyen de traiter d’autres types de cancers, y compris les xénogreffes dérivées de patients. Cela va vers l’idée d’une médecine de précision adaptée à chaque patient. Ces sondes sont fabriquées avec des techniques de microfabrication standard, de sorte que la fabrication est simple et que toute personne disposant d’une salle blanche peut les fabriquer.
Pour la structuration des électrodes en or, déposer une couche de trois micromètres de parylène C avec un système de dépôt de parylène en plaçant les lames de verre propres dans la chambre de dépôt. Pesez six grammes de parylène C dans un bateau en aluminium, placez-le dans le four, évacuez la machine et commencez le dépôt avec les paramètres décrits dans le manuscrit. Lorsque le dépôt est terminé et que la température du vaporisateur est inférieure à 40 degrés Celsius, éteignez le refroidisseur, le vaporisateur, le four.
Ventilez la machine et prélevez les échantillons. Enduire les échantillons traités au plasma d’une résine photosensible négative à 1 000 fois G pendant 40 secondes. Exposez la résine photosensible à travers un masque qui présente la conception de l’électrode interdigitée.
Ensuite, immergez les échantillons dans un révélateur sans ions métalliques pendant trois minutes pour retirer la résine photosensible non exposée. Pour déposer une couche d’adhérence de chrome de 20 nanomètres et une couche d’or de 300 nanomètres avec un évaporateur thermique, aérez l’évaporateur et clipsez les échantillons sur la plaque ronde supérieure avec des vis métalliques. Remplissez les creusets dédiés respectivement avec du chrome et de l’or.
Scellez et évacuez la machine et lancez la rotation du porte-échantillon. Sélectionnez le creuset contenant du chrome et augmentez lentement le courant jusqu’à ce que le taux de dépôt atteigne 0,2 angström par seconde. Ouvrez l’obturateur, attendez le dépôt de 20 nanomètres de chrome, fermez l’obturateur et réduisez lentement le courant jusqu’à zéro milliampère.
Sélectionnez le creuset contenant de l’or et augmentez lentement le courant jusqu’à un taux de dépôt de 0,2 angström par seconde. Ouvrez l’obturateur pour évaporer l’or, attendez le dépôt de 10 nanomètres d’or, puis augmentez le taux de dépôt à 1,5 angström par seconde jusqu’à ce qu’environ 300 nanomètres soient déposés. Fermez l’obturateur et abaissez lentement le courant jusqu’à zéro milliampère.
Plongez les échantillons dans un bécher contenant de l’acétone. Ensuite, rincez les échantillons avec de l’isopropanol et séchez-les avec un pistolet à air comprimé. Enduire quatre couches de solution PEDOT:PSS à 150 fois G pendant 35 secondes.
Retirez la couche C de parylène sacrificiel en immergeant les échantillons dans l’eau. Immerger les échantillons dans de l’eau désionisée pendant 30 minutes pour éliminer le savon restant et les composés de faible poids moléculaire dans le film PEDOT:PSS et détacher les échantillons du substrat de verre. Ajouter soigneusement 75 microlitres de solution d’agarose à 1% fondue dans chaque puits de la plaque de 96 puits et laisser se solidifier pendant 15 minutes à température ambiante.
Détacher les cellules de glioblastome transduites obtenues lors de la génération de la lignée cellulaire stable. Ajouter 10 000 cellules de glioblastome par puits et compléter le volume total à 150 microlitres par puits en utilisant DMEM contenant un gramme par litre de glucose, de L-glutamine, de pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium, 10% de sérum bovin fœtal, 100 unités par microlitres de pénicilline et 100 microgrammes par microlitres de streptomycine. Remplacer la moitié du média par un média frais tous les deux jours jusqu’à ce que d’autres expériences soient effectuées tout en gardant l’embout de la pipette dans la partie supérieure du puits pour éviter d’endommager l’agarose ou le sphéroïde lui-même.
Placez les œufs fécondés de caille japonaise, Coturnix japonica, dans un incubateur sur des plateaux munis d’un rotateur automatique qui retourne les œufs toutes les deux heures. Ce jour est considéré comme le jour embryonnaire zéro. Le troisième jour embryonnaire, ouvrez doucement les œufs à l’aide d’une pince à épiler à pointes minces prélavées avec de l’éthanol à 70%.
Versez l’embryon dans un bateau de pesage en plastique, recouvrez-le d’un autre bateau de pesage et placez-le dans un incubateur humidifié standard à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Le sixième jour embryonnaire, faites une petite incision dans la membrane chorio-allantoïdienne avec une aiguille de calibre 23. Placez un sphéroïde de sept jours sur l’incision à l’aide d’une pipette et remettez l’embryon dans l’incubateur pendant trois jours jusqu’à ce que d’autres expériences soient effectuées.
Placez une goutte de DPBS pour couvrir la craniotomie. Placez l’électrode flexible sur la goutte de DPBS et placez doucement l’arrière de la sonde avec les coussinets de contact sur le dos de la souris. Absorbez la goutte DPBS avec un petit morceau de papier jusqu’à ce que la sonde puisse reposer à plat sur la dure-mère et suivre la courbure du cerveau, en veillant à ce que la petite couche de solution saline reste sous les électrodes pour agir comme une barrière contre les débordements de colle.
Placez une petite goutte d’adhésif silicone sur la sonde et recouvrez-la d’un verre à couvercle rond de cinq millimètres. Poussez le verre de couverture vers le bas jusqu’à ce que le silicone soit réparti uniformément et que la distance entre le verre de couverture et la sonde soit minimale. Attendez ensuite 30 secondes que le silicone se solidifie.
Pour fixer le verre de couverture, appliquez rapidement de la superglue sur ses côtés et poussez-la vers le bas jusqu’à ce que la colle devienne solide. Appliquez de la super colle au cou de la sonde à l’aide d’un cure-dent en veillant à ce que la super colle soit aspirée sous le cou pour fournir un soutien stable. Couvrez le crâne avec du ciment dentaire pour construire un capuchon chronique et prenez soin de couvrir les bords du verre de couverture seulement.
Soulevez l’arrière de la sonde et appliquez du ciment sous le col de la sonde. Reste de la sonde sur le ciment avant qu’il ne durcisse. Poussez doucement le col de la sonde pour placer sa surface au même niveau que le verre de couverture et non sur le chemin de l’objectif du microscope pendant l’expérience.
Couvrez le haut du col de la sonde avec pas plus de 1,5 millimètre de couche de ciment dentaire pour obtenir une prise ferme sur la sonde. Construire un puits de ciment présentant une crête de 1,5 millimètre à un à deux millimètres autour du verre de couverture pour créer un bassin pour le fluide d’immersion pour l’imagerie à deux photons. Une fois le ciment durci, administrez une analgésie postchirurgicale et gardez l’animal au chaud jusqu’à sa guérison en l’enveloppant dans une serviette en papier et en le plaçant près d’une ampoule infrarouge.
Les électrodes revêtues de PEDOT:PSS montrent les régions dominées capacitives et résistives typiques séparées par une fréquence de coupure, tandis que les électrodes non revêtues n’affichent qu’un comportement capacitif. La croissance des sphéroïdes observée avec un microscope à fond clair a révélé qu’au moins deux ou trois jours sont nécessaires pour obtenir des sphéroïdes sphériques et denses en fonction de la lignée cellulaire et du nombre de cellules ensemencées. Dans le modèle in ovo, la greffe de sphéroïdes dans la membrane chorio-allantoïdienne peut être évaluée par microscopie à fluorescence car les cellules vivantes ont du calcium intracellulaire et la vascularisation de la tumeur peut être évaluée en injectant un colorant fluorescent dans les vaisseaux sanguins.
Par rapport à l’impédance en solution saline, une augmentation de l’impédance est attendue in vivo à des fréquences supérieures à 100 hertz en raison de la présence d’un environnement biologique. Le parenchyme neural vascularisé et l’infiltration tumorale peuvent être observés et caractérisés à travers le substrat transparent pendant des semaines par deux microscopies à photons. L’utilisation d’animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des cellules d’intérêt peut démontrer le processus inflammatoire minimal induit par l’implantation d’électrodes seules.
Il peut montrer la présence de microglies et de monocytes 26 jours après l’implantation de champs électriques pulsés stimulés par électrode. Des cellules microgliales dérivées de monocytes périphériques et résonantes cérébrales ont été trouvées autour et à l’intérieur de la tumeur. Le point critique pour le succès de la procédure implantaire est d’assurer l’étanchéité et la planéité de la fenêtre crânienne et d’optimiser la qualité du contact avec la sonde.
En plus de l’imagerie intravitale, quoi que ce soit envisager de combiner notre protocole avec d’autres mesures et techniques comme les prélèvements et les mesures des analyses sanguines pour les cytokines, le statut immunitaire par cytométrie de flux, ou encore l’analyse comportementale. Ces travaux ouvrent la voie à l’utilisation de dispositifs implantables flexibles pour le cancer et ouvrent de nouvelles perspectives pour l’utilisation de la médecine bioélectronique pour cette maladie chronique.
