Ce protocole permet d’étudier le potentiel et la capacité de la glie de Muller à se convertir en cellules progénitrices rétiniennes après traitement avec des facteurs spécifiques tels que les microARN. L’avantage de cette technique est que les candidats microARN peuvent être testés pour leur efficacité et leurs résultats avant leur utilisation dans des applications in vivo. Seoyoung Kang, doctorant du laboratoire de Stefanie Wohl, aidera à démontrer la procédure.
Tout d’abord, trempez brièvement le globe oculaire enlevé dans un tube avec de l’éthanol pour éviter la propagation des bactéries de l’animal. Ensuite, lavez brièvement le globe oculaire dans la boîte de Petri de 10 centimètres avant de le placer dans la plaque de 24 puits sur la glace. Une fois les globes oculaires enlevés et nettoyés, placez un œil dans la boîte de dissection placée sous un microscope à dissection avec une source de lumière.
Maintenant, fixez un globe oculaire en saisissant le nerf optique et le tissu conjonctif environnant autour de la sclérotique avec une pince fine Dumont 5 et pressez-le soigneusement contre le plat de dissection. Ensuite, faites un trou dans le centre de la cornée à l’aide d’une aiguille de calibre 30 pour permettre un accès plus facile aux ciseaux veineux. Ensuite, disséquez la cornée autour du corps ciliaire à l’aide de ciseaux veineux et retirez délicatement la cornée, le cristallin, l’iris et le corps vitré avec une pince fine Dumont 5.
Plus tard, disséquez la sclérotique avec des ciseaux veineux jusqu’à ce que le nerf optique soit atteint et extrayez soigneusement la rétine à l’aide de pinces fines Dumont 5. Utilisez maintenant une deuxième pince fine Dumont 5 pour pousser contre la rétine et retirer complètement le corps vitré. Transférer les rétines couper environ 2,5 centimètres de l’extrémité d’une pipette de transfert stérile pour agrandir le diamètre.
Maintenant, en utilisant cette astuce, ramassez des rétines entières sans endommager le tissu et transférez les rétines dans une nouvelle boîte de Petri stérile avec HBSS froid et bercez la boîte. Ensuite, à l’aide d’une nouvelle pipette de transfert stérile, poussez soigneusement les rétines pour éliminer les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes. Placez immédiatement la rétine isolée dans un nouveau puits propre de la plaque de 24 puits remplie d’un millilitre de HBSS tout en gardant la plaque de 24 puits sur la glace pendant la dissection.
Préparer le mélange de dissociation de la papaïne DNase I comme décrit dans le manuscrit. Maintenant, avec une pipette de transfert de pointe agrandie, ramassez les rétines. Attendez que les rétines se déposent au bas de la pointe et libèrent les rétines sans HBSS excessif dans le tube contenant le mélange de Papain DNase I.
Ensuite, placez le tube sur un nutator dans l’incubateur et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, dissociez les cellules en pipitant soigneusement de haut en bas avec une pipette d’un millilitre. Une fois les cellules dissociées, ajoutez 275 microlitres d’inhibiteur de protéase ovomucoïde du kit de dissociation de la papaïne pour neutraliser la papaïne et mélangez doucement en pipetant de haut en bas.
Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner à quatre degrés Celsius pendant huit minutes à une force centrifuge relative de 300. Ajouter le facteur de croissance épidermique au volume calculé du milieu de croissance préchauffé à 37 degrés Celsius. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse.
Sans toucher la pastille au fond du tube, retirez le surnageant soigneusement et entièrement. Maintenant, remettez en suspension la pastille cellulaire avec 500 microlitres de facteur de croissance épidermique complété par le milieu de croissance. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un puits de la plaque de 12 puits étiquetée.
Rincez le tube avec 500 microlitres supplémentaires du milieu de croissance supplémenté en facteur de croissance épidermique et ajoutez-le au puits. Balancez soigneusement la plaque de puits, puis placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec du dioxyde de carbone. Commencez par vérifier la confluence des cellules de 90 % à 100 %.
Ensuite, retirez le milieu et ajoutez un millilitre de HBSS froid pour laver le puits. Balancez doucement la plaque et retirez HBSS sans laisser de traces. Plus tard, ajoutez 500 microlitres d’une solution contenant de la trypsine préchauffée pour détacher les cellules du puits.
Rock doucement et incuber pendant deux minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après avoir déplacé la plaque de l’incubateur à l’armoire de biosécurité, aspirez la solution contenant de la trypsine en l’inclinant. Dispersez-le soigneusement et lentement sur le puits plusieurs fois jusqu’à ce que les cellules se détachent complètement.
Ensuite, transférez cette suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 millilitre et insérez des tubes dans la centrifugeuse. Faire tourner à 300 fois g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius et ramener les tubes dans l’enceinte de biosécurité. Retirez le surnageant sans toucher la pastille.
Maintenant, remettez soigneusement en suspension la pastille cellulaire en ajoutant 600 microlitres de milieu de croissance préchauffé et en pipetant de haut en bas environ 30 à 40 fois. Enfin, ensemencez 100 microlitres de la suspension cellulaire obtenue au centre de six glissements de couverture revêtus de la plaque de 24 puits. Placez la plaque sur l’incubateur et laissez les cellules se déposer pour une transfection ultérieure en utilisant des micro-imitations d’ARN.
La figure montre les conditions de contrôle cinq jours après la transfection avec quelques cellules Ascl1-Tomate positives présentes. Cependant, après un traitement miR-25, beaucoup plus de cellules Ascl1-Tomate positives sont trouvées. La quantification a révélé une multiplication par quatre du nombre de cellules Ascl1-Tomato positives dans les puits traités miR-25 par rapport aux témoins.
Plus important encore, la grande majorité des cellules Ascl1-Tomate positives trouvées dans les puits traités riR-25 ont adopté une morphologie neuronale. Les caractéristiques de cette morphologie neuronale comprenaient la réduction de la taille du soma cellulaire, le développement de processus fins et la formation de minuscules réseaux. La quantification a révélé qu’environ 70% de toutes les cellules Ascl1-tomate positives avaient des caractéristiques neuronales.
Le marquage immunofluorescent montre que les cellules Ascl1-Tomate positives avec une morphologie neuronale expriment les marqueurs neuronaux OTX2 et MAP2, confirmant l’identité neuronale. La quantification de ces cellules a révélé qu’après la surexpression de miR-25, environ 40 neurones Ascl1-Tomato positifs par champ sont présents par rapport à cinq cellules neuronales par champ chez les témoins. Les cellules neuronales identifiées constituent environ 70% de la population totale de cellules Ascl1-Tomato positives des échantillons traités miR-25.
De plus, la quantification du nombre absolu de neurones coexprimant OTX2 et MAP2 a montré qu’après le traitement miR-25, environ 60 neurones par champ ont été trouvés contre 10 neurones par champ chez les témoins. Il est impératif de travailler dans un environnement propre et aseptisé avec des outils propres et stériles et de travailler avec soin en évitant tout traitement sévère. Les applications en aval peuvent être, par exemple, la quantification des protéines, l’analyse de l’ADN ou de l’ARN, ou des études électrophysiologiques.
Cette technique nous a permis d’explorer les questions initiales sur la reprogrammation nucléaire qui appartient au domaine de la médecine régénérative. Et il existe un large éventail de facteurs et de conditions qui peuvent être testés afin d’explorer de nouvelles questions.
